人肝再生增強(qiáng)因子免疫抑制機(jī)制研究.pdf

1、目的：人肝再生增強(qiáng)因子（human augmenter of liver regeneration，hALR）是一種非特異性的、具有熱穩(wěn)定性的、促肝細(xì)胞再生的細(xì)胞因子，能抑制單核細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子INF-γ、IL-2的產(chǎn)生，但抑制機(jī)制仍不明確。MAPK/ERK、PKC-NF-KB、鈣離子信號通路是外周血單核細(xì)胞活化的主要通路，是很多免疫抑制劑作用的靶點(diǎn)，目前不清楚ALR是否抑制這幾條通路發(fā)揮免疫抑制作用，因此，本研究擬從體外觀察ALR

2、對外周血單核細(xì)胞這三條信號通路的影響，明確ALR的作用機(jī)制。 凋亡是免疫抑制的另一種重要方式，我們前期發(fā)現(xiàn)rALR能誘導(dǎo)大鼠單核細(xì)胞凋亡，但是機(jī)制仍不明確，是通過減少免疫營養(yǎng)因子IL-2抑或刺激凋亡信號通路？因此，本研究也觀察人ALR對凋亡相關(guān)的信號通路Caspse-3及IL-2等細(xì)胞因子的影響，以期探明ALR免疫抑制機(jī)制。 方法： 1. ALR對MAPK/ERK的影響 1）觀察ALR抑制ConA促PBM

3、C增殖作用的最佳時間和濃度用MTT法觀察ConA（5ug/ml）在16h、40h、60h對PBMC的促增殖作用，以P<0.01的時間作為ConA促PBMC增殖的最佳作用時間；選定60h時間點(diǎn)，觀察系列濃度ALR（0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、7.5ug/ml、10 ug/ml、15 ug/ml、30 ug/ml）抑制ConA的促增殖作用，以P<0.01的濃度作為ALR的最佳濃度。 2）觀察MAPK/ERK的變化根

4、據(jù)最佳時間（60h）和濃度（30ug/ml），將細(xì)胞分成正常對照組（Normal control，N）、ALR對照組、ConA和ALR+ConA組，利用Western Blot法觀察ALR在60h對MAPK/ERK的影響。 3）動態(tài)觀察MAPK/ERK的變化在明確ERK變化的基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀察ALR在10min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、32h、40h時間點(diǎn)對ERK的影響，以明確ALR抑制ERK的過程。

5、2. ALR對Ras的影響利用Western Blot法觀察ALR對Ras的影響及其影響是否與ERK同步，從而確定ALR是否經(jīng)Ras-MAPK/ERK通路抑制細(xì)胞增殖。 3. ALR對PKC-NF-KB通路的作用用Western blot法觀察PKC、NF-KB的變化，以明確ALR在培養(yǎng)中期是否通過抑制PKC-NF-KB起免疫抑制作用。 4. ALR對鈣離子信號通路的作用在明確ALR對以上兩條信號通路的作用后，ALR在4

6、-8h的作用通路仍不明確，因此進(jìn)一步觀察鈣離子信號通路變化。利用鈣離子敏感探針裝載，熒光分光光度計動態(tài)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，利用甲基百里香酚藍(lán)比色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的鈣離子濃度。 5. ALR對凋亡的作用利用流式細(xì)胞儀檢測ALR對PBMC凋亡的影響，用凝膠電泳法觀察DNA是否降解，用Western Blot法觀察ALR是否有活化Caspase-3的作用。 6. ALR對IL-2、IL-4、IL-10的影響用EL

7、ISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-10的動態(tài)變化。 結(jié)果: 1. ALR對MAPK/ERK的影響 1）ConA對單個核細(xì)胞的增殖作用隨時間的增加而逐漸增強(qiáng)，16h和40h時增殖明顯（p=0.0413，0.0479），60h時最顯著（p<0.01）。ALR抑制增殖呈劑量依賴關(guān)系，劑量為30 ug/ml時抑制作用最明顯（p<0.01）。 2）ERK在60h的變化與正常組比較，ConA組磷酸

8、化的ERK含量及非磷酸化的ERK含量均增加；ALR組磷酸化的ERK2含量減少。ALR+ConA組磷酸化及非磷酸化的ERK含量較ConA組均減少，并以磷酸化的ERK2減少為主。各組磷酸化ERK與非磷酸化ERK之比沒有差異。 3）ALR對ERK的動態(tài)影響磷酸化ERK含量變化：ConA組磷酸化ERK的含量在1h時較正常組明顯增加，ALR組磷酸化ERK的含量在10min和1h時。ALR+ConA組磷酸化ERK的含量在10min、30mi

9、n和1h時較ConA組明顯減少，以ERK2為主；各組磷酸化ERK的含量在4h以后均無明顯差別，且達(dá)到最低值。 非磷酸化ERK含量變化：各組非磷酸化ERK的含量隨時間逐漸增加，在4-16h達(dá)到較高水平，之后下降，40h最低。 2. ALR對ras的影響在整個細(xì)胞培養(yǎng)過程中，各組Ras呈多次波動，其中N組（10min-1h、1-8h、8-40h）和ConA組（10min-1h、1-4h、4-40h）Ras呈現(xiàn)3次波動，而AL

10、R+ConA組（1-8h、8-40h）和ALR組（1-8h、8-40h）出現(xiàn)2次。ALR+ConA組Ras在10min-1h之間明顯被抑制，程度明顯低于ConA組，以30min為著；之后變化與ConA組并行。ALR組Ras除1h低于N組外，之后均與N組并行。ConA組和ALR+ConA組細(xì)胞內(nèi)Ras在16h均明顯低于正常組。 3. ALR對PKC-NF-KB通路的作用各組PKC、NF-KB表達(dá)的總體變化趨勢一致，PKC-NF-K

11、B系統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)8h之后發(fā)生改變，ConA組PKC、NF-KB表達(dá)的最高值在16h，ALR+ConA組PKC、NF-KB表達(dá)最高值明顯后移，在32h。ALR+ConA組PKC、NF-KB抑制最強(qiáng)點(diǎn)在16h 4. ALR對PBMC鈣離子信號通路的作用除ALR+ ConA組鈣離子在4h之前沒有波動外，各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子均有先升高后下降的現(xiàn)象，ALR組鈣離子水平在30min時達(dá)到最高點(diǎn)；ConA組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度最高點(diǎn)在1h，N組細(xì)胞內(nèi)

12、鈣離子濃度最高點(diǎn)在2h。各組之間鈣離子水平在4h時沒有統(tǒng)計學(xué)差異。8h后ALR組出現(xiàn)兩次波動。 5. ALR對PBMC凋亡的作用60h之前，各組細(xì)胞沒有凋亡；60h時，ALR組和ConA組細(xì)胞早期凋亡與正常組明顯增加；而ALR+ConA組較ConA組細(xì)胞早期凋亡明顯減少。60h時，ALR+ConA組Caspase-3含量較ConA組明顯減少。 6. ALR對細(xì)胞因子的影響ALR組IL-2的分泌最高峰在16h，IL-10峰

13、值在32h，與ConA組IL-2和IL-10分泌峰值相同。ALR+ConA組IL-2峰值推遲，IL-10峰值提前。 結(jié)論: 1. ALR通過抑制Ras-MAPK/ERK2通路從而抑制ConA的促人PBMC增殖作用。 2. ALR對未經(jīng)ConA刺激的人PBMC MAPK/ERK具有雙向調(diào)節(jié)作用，早期促進(jìn)ERK的磷酸化，晚期抑制ERK2的磷酸化。 3. ALR通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號從而抑制人PBMC增殖。