人BAFF免疫抑制分子的構(gòu)建及功能鑒定.pdf

1、TNF家族的B細(xì)胞活化因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily，BAFF)是一種重要的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，它有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式，二者的生物學(xué)活性基本一致，不僅廣泛參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育、分化及抗體的產(chǎn)生，而且還廣泛參與T細(xì)胞的活化和應(yīng)答過程。BAFF缺乏可導(dǎo)致免疫功能低下；而BAFF過表達(dá)則密切參與了同時(shí)涉及B、T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)

2、節(jié)炎(RA)及干燥綜合征(SS)等多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，而且血清中BAFF的水平與這些疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)；用抗-BAFF抗體或其可溶性受體抑制BAFF的功能可緩解相關(guān)疾病的癥狀。因此，BAFF被認(rèn)為是治療這些自身免疫性疾病的理想靶標(biāo)。 近年研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)異源性Th表位修飾的細(xì)胞因子突變體可構(gòu)成一種新抗原，由這種新抗原所誘導(dǎo)出的抗體可與天然細(xì)胞因子發(fā)生交叉結(jié)合反應(yīng)，從而抑制天然細(xì)胞因子的功能。為此，我們在克隆了人可溶性BA

3、FF(胞外區(qū)134-285位氨基酸，sBAFF)cDNA的基礎(chǔ)上，經(jīng)反向PCR致突變法分別構(gòu)建了缺失不同區(qū)域的sBAFFcDNA突變體(msBAFF)，然后將人工合成的Th表位DNA序列分別與編碼各msBAFF的DNA重組并克隆于原核表達(dá)載體，經(jīng)原核表達(dá)和純化制備由msBAFF和Th表位組成的重組突變體蛋白，進(jìn)而檢測了相應(yīng)重組突變體蛋白活化淋巴細(xì)胞的情況，最后分別用重組蛋白免疫BALB/c小鼠和人化SCID小鼠，觀察重組蛋白交叉誘導(dǎo)抗人

4、sBAFF抗體的情況以及相應(yīng)抗體抑制人野生型sBAFF活化淋巴細(xì)胞的功能。所取得的主要研究結(jié)果如下： 1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人可溶性BAFF的cDNA，經(jīng)查對，與GenBank上登錄的相應(yīng)序列完全一致。以獲得的pUC19-sBAFF為模板，經(jīng)一步反向PCR致突變法成功構(gòu)建了缺失不同區(qū)域的sBAFFcDNA突變體，并分別與編碼雞卵清溶菌酶(HEL)或卵清蛋白(OVA)Th表位的DNA序列重組，重組質(zhì)粒命名為pUC19-

5、HELmsBAFF1～5和pUC19-OVAmsBAFF1～5。 2.將測序正確的重組DNA分別連接于原核表達(dá)載體pQE80L，成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE80L-HELmsBAFF1～5和pQE80L-OVAmsBAFF1～5。上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后各重組蛋白均獲得了較高水平的表達(dá)，并確定了各重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式。 3.各重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA層析柱純化后在SDS-PAG

6、E上呈現(xiàn)單一條帶，灰度掃描分析證實(shí)，各重組蛋白的純度在90％以上。生物學(xué)活性分析顯示，本實(shí)驗(yàn)所制備的重組突變體蛋白均喪失了刺激人外周血淋巴細(xì)胞和Raji細(xì)胞增殖的功能。 4.用純化的重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠，在第二次免疫后各小鼠血清中均可檢測到較高滴度的抗人可溶性BAFF抗體，加強(qiáng)免疫后抗體水平繼續(xù)升高，至第6周時(shí)達(dá)高峰，效價(jià)在1∶12800～1∶51200之間；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫小鼠血清中的抗體可明顯抑制人重組

7、sBAFF和天然sBAFF刺激細(xì)胞增殖的功能，這說明各重組蛋白均可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生抗sBAFF中和性抗體。通過對抗體效價(jià)和抑制能力的比較，我們篩選出四種可誘導(dǎo)較高滴度抗人sBAFF抗體的融合蛋白：HELmsBAFF3、HELmsBAFF5、OVAmsBAFF1和OVAmsBAFF5。 5.用人淋巴細(xì)胞重建了SCID小鼠的免疫功能，重建成功率達(dá)100％。用篩選出的重組蛋白免疫人化SCID小鼠，第三次免疫后實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中可

8、檢測到抗sBAFFIgG抗體的存在，末次免疫后實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中抗體滴度達(dá)到高峰，隨時(shí)間延長抗體滴度下降，并且免疫小鼠血清中的抗體可抑制重組sBAFF刺激淋巴細(xì)胞增殖的功能，表明所制備的重組蛋白可誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗人sBAFF抗體。 以上研究結(jié)果表明，我們通過基因重組技術(shù)成功制備了sBAFF的免疫抑制分子，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其交叉誘導(dǎo)抗人sBAFF抗體的能力以及相應(yīng)抗體抑制人sBAFF活化淋巴細(xì)胞的功能。本研究為進(jìn)一步探討所制備