髓初始髓源抑制細胞亞群表型鑒定及對t細胞免疫抑制功能的研究-免疫學

1、<p><b>　　主要英文縮略語索引</b></p><p><b>　　中文摘要</b></p><p>　　目的： MDSCs是一群異質(zhì)性的細胞，通常在腫瘤，感染，炎癥和移植等病理情況時增多。一般認為，在病理狀態(tài)下，MDSCs對免疫系統(tǒng)具有廣泛的抑制作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能；而正常狀態(tài)下，MDSCs是否具有免疫抑制作用尚有爭論

2、。目前，多數(shù)研究針對腫瘤和感染等病理條件下混合MDSCs或MDSCs的亞群進行研究，而對骨髓初始MDSCs的研究相對較少。本實驗旨在使用Gfi1:GFP基因敲入小鼠模型，從正常模型小鼠的骨髓中分離初始MDSCs （naïve MDSCs），運用流式細胞儀（BD FACS Aria）分選不同亞群細胞，采用免疫學方法，研究初始MDSCs及其亞群在正常情況下可能具有的表型和T細胞免疫抑制功能；重點研究骨髓naïve MDS

3、Cs不同亞群對T細胞功能的影響及其機制。</p><p>　　方法：通過對Gfi1：GFP基因敲入C57BL/6J小鼠模型骨髓細胞分離純化，利用免疫磁珠技術分離骨髓初始MDSCs(CD11b+細胞)，流式細胞儀檢測分選純度；利用離心涂片法和Wright Giemsa染色法對初始MDSCs進行形態(tài)學分析；將骨髓初始MDSCs分別與CD3/28 Dynabeads T-Activator預刺激的CD4+T或CD8+T

4、細胞共培養(yǎng)，流式細胞術檢測它們對CD4+T和CD8+T細胞增殖功能的影響。利用流式細胞技術根據(jù)CD11b 、Gr1和Gfi1:GFP表達的差異將MDSCs 分為不同亞群，并鑒定其表型CD62L、Ly6C、CD204、CD206、CD80、CD86、TLR4、TLR2、CD124、CD210等的表達差異；用離心涂片法和Wright Giemsa染色法對不同亞群進行形態(tài)學分析；用純化的骨髓初始MDSCs的不同亞群細胞分別與CD3/28 Dy

5、nabeads T-Activator預刺激的CD4+T或CD8+T細胞共培養(yǎng)，流式細胞術檢測它們對CD4+T和CD8+T細胞增殖功能的影響；并應用Realtime-PCR方法檢測不同亞群細胞抗炎因子及相關</p><p>　　結果： 骨髓初始MDSCs是健康小鼠免疫細胞的重要組成成分，其形態(tài)為大小不一、胞質(zhì)呈淡藍色、核為分葉形、環(huán)形或橢圓形的細胞群；初始MDSCs在體外可以抑制CD4+T和CD8+T細胞增殖，在

6、體內(nèi)可以延緩和降低小鼠急性肝衰竭模型的死亡率。按CD11b 、Gr1和Gfi1:GFP等分子表達的差異及細胞形態(tài)學差異可將初始MDSCs分為四個亞群：CD11b+Gr1+ GFP-（M1）、CD11blowGr1low GFP+（G1）、CD11blowGr1high GFP+（G2）及CD11bhighGr1high GFP+（G3）。在正常小鼠骨髓細胞中，G1群細胞占骨髓總細胞的1.19±0.38%，占骨髓初始MDSCs的

7、4.04±0.9%；G2群細胞占骨髓總細胞的8.49±2.69%，占骨髓MDSCs的28.9±5.25%；G3群細胞占骨髓總細胞的6.04±1.55%，占骨髓MDSCs的20.95±4.98%；M1群細胞占骨髓總細胞的3.86±1.06%，占骨髓MDSCs的13.25±2.65%。G1群細胞體積較大主要是以環(huán)形核幼稚的粒細胞為主，G2群細胞以環(huán)形核和分葉核的幼稚粒細胞

8、為主，G3群</p><p><b>　　結論： </b></p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs（CD11b+細胞）能分別抑制CD4+T或CD8+T細胞增殖，并且能延緩和降低小鼠急性肝衰竭模型的死亡率。</p><p>　　根據(jù)初始MDSCs的CD11b 、Gr1和Gfi1:GFP表達差異及細胞形態(tài)學差異可將其可分為M1、G1、G2及

9、G3四個亞群：單核系亞群細胞M1（CD11b+Gr1+ GFP-）和粒系亞群細胞G1（CD11blowGr1low GFP+）、G2 （CD11blowGr1high GFP+）及G3（CD11bhighGr1high GFP+）。</p><p>　　在骨髓初始MDSCs四個亞群中，G2和G3均能不同程度的抑制CD4+T和CD8+T細胞增殖，而G1和M1對CD4+T和CD8+T細胞的增殖無明顯抑制作用；G2亞群

10、細胞可能通過分泌抗炎因子IL-4、IL-10發(fā)揮免疫抑制作用，G3亞群細胞可能通過分泌抗炎因子IL-10和炎性因子IFN-γ發(fā)揮免疫抑制作用。</p><p>　　骨髓初始MDSCs的G2和G3亞群細胞對CD4+T和CD8+T細胞增殖抑制作用的機制可能與NOS2和ArgI 兩種酶無關。</p><p>　　關鍵詞：初始髓源抑制細胞；細胞亞群；免疫抑制；T淋巴細胞</p>&l

11、t;p>　　Identification of Bone Marrow Naive Myeloid-Derived Suppressor Cells Subpopulations with Distinct Phenotype and T Cell Suppressive Activity</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　

12、　Objectives：</p><p>　　MDSCs are a group of heterogeneous cells, usually increased in tumor, infection, and inflammation and transplantation disease. It has a broad inhibitory function to immune system in pat

13、hological conditions and plays a regulator of the immune system; it is a debate about the inhibitory function of naïve MDSCs in normal condittions. Currently, mixed-MDSCs or different subsets of MDSCs have been rese

14、arched in different pathological conditions such as cancer and infection. This study used the bone m</p><p>　　The bone marrow cells of C57BL/6J Gfi1: GFP knockin mouse model were separated and purificated, n

15、aïve MDSCs of bone marrow were isolated by immunomagnetic beads (CD11b microbeads kit), the purity of naïve MDSCs was detected by FCM; the morphology naïve MDSCs was analyzed of by smear of centrifugation

16、and staining of Wright-Giemsa; Identification naïve MDSCs with CD4+T cells or CD8+T cells pre-stimulated by Dynabeads CD3/28 T-Activator and were cultured to detect CD4+ T and CD8+ T cells function </p><p

17、>　　Naïve MDSCs are important components of normal mice immune system, the morphology of total MDSCs in the bone marrow is large and small, the cytoplasm is blue, and the shape of nucleus is sub-leaf, ring and ova

18、l. CD4+T or CD8+T cells proliferation were inhibited by naïve MDSCs (CD11b+ cells) of normal mice bone marrow, and the mortality of acute hepatic failure (AHF) mice models were delayed and decreased by naïve MD

19、SCs. It could be devided into CD11blowGr1low GFP + (G1), CD11blowGr1highGFP+(G2),</p><p>　　Conclutions：</p><p>　　CD4+T or CD8+T cells proliferation were inhibited by naïve MDSCs (CD11b+ cel

20、ls) of normal mice bone marrow, and the mortality of acute hepatic failure (AHF) mice models were delayed and decreased by naïve MDSCs.</p><p>　　CD11blowGr1lowGFP+(G1),CD11blowGr1highGFP+(G2),CD11bhighG

21、r1highGFP+(G3), CD11b+Gr1lowGFP-(M1) subsets of naïve MDSCs were isolated from bone marrow of Gfi1: GFP knockin normal mice by the difference of Gfi1-GFP , CD11b and Gr1 expression. </p><p>　　In four su

22、bsets of naïve MDSCs, G2 and G3 subsets have different levels of inhibition of CD4 +T or CD8+T cell proliferation respective. However, G1 and M1 subsets of naive MDSCs had no significant inhibition to CD4+T or CD8+T

23、 cells. G2 subset of naïve MDSCs maybe play an immunosuppressive effect by increasing the levels of anti-inflammatory cytokines, such as IL-4 and IL-10. G3 subset of naïve MDSCs maybe play an immunosuppressive

24、effect by increasing the levels of anti-inflammatory cytokines, s</p><p>　　The T cells inhibitory mechanism of G2 and G3 subsets may be not related to NOS2 and ArgI.</p><p>　　Postgraduate： Dongp

25、ing Ren</p><p>　　(Majoring in immunology)</p><p>　　Directed by： Professor Jianhua Xiao</p><p>　　Professor Hui Zeng</p><p>　　Key words:</p><p>　　Naïve

26、Myeloid-derived Suppressor Cells, Cell Subsets, Immune Suppression, T Lymphocytes.</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　髓源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells;MDSCs）是一群異質(zhì)性的細胞，包括髓系祖細胞和未成熟髓樣細胞

27、等，最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤患者體內(nèi)，隨后人們也發(fā)現(xiàn)在感染性疾病，炎癥和移植等病理狀態(tài)下累積。目前認為，這群細胞數(shù)量的增多及其免疫抑制功能與細菌、病毒、寄生蟲感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展和移植等病理情況密切相關[1-3]。生理情況下，具有MDSCs表型的細胞主要存在于骨髓造血細胞中，而在脾臟、外周血和淋巴結中含量較低；該細胞群的特征類似于髓系前體細胞，可以在體外培養(yǎng)中分化為不同的細胞集落，如體外培養(yǎng)中添加粒-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte m

28、acrophage-colony-stimulating factor，GM-CSF）及相關細胞因子可以誘導其向粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)分化。而在病理狀態(tài)下，只有部分髓源抑制細胞可以分化為粒細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞[4-6]。</p><p>　　普遍認為，髓源抑制細胞具有廣泛的免疫抑制功能，如抑制B細胞分泌抗體，抑制DC細胞的成熟和抗原提呈作用，抑制NK細胞的殺傷

29、作用以及抑制CD4+ T和CD8+ T細胞增殖和干擾素γ（IFN-γ）分泌[7-9]。有研究表明粒-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony-stimulating factor，GM-CSF），血管內(nèi)皮生長因子（vsacular endothelial growth factor,VEGF）,白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和前列腺素（prostaglandins）可以動

30、員并募集骨髓造血祖細胞[8-13]。一般認為，MDSCs可以表達高水平的誘導性一氧化氮合酶（iNOS or NOS2），這種酶可以分解環(huán)境中所存在的T細胞活化所必需的精氨酸生成瓜氨酸（citrulline）和一氧化氮（nitric oxide；NO），從而導致CD4+T和CD8+T細胞活化受阻[14]。此外，MDSCs還可以表達精氨酸酶I（Arginase-I;ArgI）減少內(nèi)環(huán)境中L-精氨酸的利用率，從而導致CD3ζ表達缺失，進而妨礙

31、</p><p>　　目前研究表明MDSCs可能源自髓系祖細胞，可在不同的病理狀態(tài)累積，對T淋巴細胞具有免疫抑制作用，其抑制作用機制研究已經(jīng)取得了較多的證據(jù)[16-18]。但是，由于MDSCs是一個異質(zhì)的細胞群體，主要由粒系，單核系兩個不同分化方向的細胞組成，另外還包括少量的淋巴樣細胞。通常認為，小鼠MDSCs共表達CD11b和Gr1兩種表面標志，在病理狀態(tài)下，對機體免疫系統(tǒng)具有廣泛的免疫抑制作用，但在正常狀態(tài)下

32、，是否具有免疫抑制作用尚有爭論。為了研究MDSCs的特征和作用機制，已有報道將MDSCs分為幾個具有特征標志的亞群：如多形核細胞和單個核細胞、單核樣細胞和粒細胞樣亞群等[18,19]。由于既往的研究多是針對混合細胞進行，而小鼠MDSCs均表達CD11b和Gr1，除此之外無其他特異的表面標志用于粒系和單核系細胞分群，因此，對MDSCs理想的分群方法和研究存在爭議。Young等[20]研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)Grl的兩個不同抗原表位LY6G和LY6C

33、表達水平的差異，可將荷瘤小鼠脾臟MDSCs分為兩個不同的細胞亞群：具有CD11b+LY6G+LY6Clow表型的多形核樣亞群及CD11b+LY6G-LY6Chigh表</p><p>　　為了研究正常小鼠骨髓初始MDSCs是否具有免疫抑制功能及其作用機制，本課題從正常Gfi1-GFP+/-小鼠骨髓中分離初始MDSCs細胞，通過體外實驗研究其對T細胞的免疫抑制作用，通過體內(nèi)實驗研究其對機體廣泛免疫抑制作用；采用流式

34、細胞儀分選和形態(tài)學方法對其進行分群；并對不同亞群細胞進行了免疫功能和作用機制研究。旨在探討正常小鼠骨髓初始MDSCs及其亞群的免疫功能差異和作用機制。</p><p><b>　　實驗材料</b></p><p><b>　　實驗動物</b></p><p>　　C57 BL /6J Gfi1:GFP基因敲入小鼠（Gfi1

35、GFP/+），6～8周，雄性，加拿大蒙特利爾大學Tarik Moroy教授實驗室贈送,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。</p><p>　　野生型C57 BL /6J小鼠，6～8周，雄性，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究中心。許可證編號：SCXI（京）2009-0007。</p><p><b>　　2．主要實驗試劑</b></p><p>　

36、　2.1抗體、培養(yǎng)基及試劑盒</p><p>　　Percp-Cy 5.5 conjugated Rat Anti-Mouse CD11b antibody (Cat:550993,Lot:22933)、</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody (Cat:553129,Lot:32918)、</p><p

37、>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody (Cat:553128,Lot:09488)、</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse CD62L antibody （Cat:553152;Lot:87443）、</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse CD124

38、antibody（Cat:552509;Lot:90410）、</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse CD210 antibody（Cat:559914;Lot:18318）</p><p>　　以上抗體購自美國BD Bioscience公司；</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse C

39、D80 antibody（Cat:104714;Lot:B124520）、</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse CD86 antibody（Cat:105012;Lot:B107034）：購自美國Biolegend公司；</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse TLR-2 antibody（Cat:12-90

40、21-80;Lot:E018505）、</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse TLR-4 antibody（Cat:12-9041-80;Lot:E023689）：購自美國eBioscience公司；</p><p>　　Anti-biotin-APC（Cat:130-090-858）：購自德國Miltenyi Biotec公司；</p>

41、<p>　　CD4+T cell isolation kit ,mouse;（Cat:130-090-860）：購自德國Miltenyi Biotec公司；</p><p>　　CD11b+cell isolation kit,mouse; (Cat:130-049-601)：購自德國Miltenyi Biotec公司；</p><p>　　CD8+T cell isolat

42、ion kit ,mouse;（Cat:130-090-859）：購自德國Miltenyi Biotec公司；</p><p>　　Gibco® RPMI-1640培養(yǎng)基（Cat:11875-093）：購自美國Invitrogen公司；</p><p>　　FBS：購自美國PAA公司；</p><p>　　BSA：購自美國KH公司；</p>

43、<p>　　Dynabeads® Mouse T-Activator CD3/28（Cat.No.114.52D）：購自美國Invitrogen公司；</p><p>　　BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (Cat.No.554714) :購自美國BD Biosciences公司；</p><p>　　B

44、D FACS®Lysing Solution (Cat.No.349202)：購自美國BD Biosciences公司；</p><p>　　RNeasy Plus Mini Kit(Cat.:74134 Lot.:127150466):購自德國QIAGEN公司；</p><p>　　TaqMan®High Capacity RNA-to-cDNA Kit（Cat.N

45、o.4387406） ；</p><p>　　TaqMan®IL-10, molecule probe（Cat:Mm00439615-g1 ,Lot:798831）；</p><p>　　TaqMan®IL-4, molecule probe（Cat: Mm 0045259 ,Lot:791932）；</p><p>　　TaqMan®

46、Arg1, molecule probe（Cat: Mm 00475988 ,Lot:683783）；</p><p>　　TaqMan®NOS2, molecule probe（Cat: Mm 0040483 ,Lot:707143）；</p><p>　　TaqMan®IL-13, molecule probe（Cat: Mm 00434205 ,Lot:80456

47、3）；</p><p>　　TaqMan®IFN-γ, molecule probe（Cat: Mm 99999071 ,Lot:801588）；</p><p>　　TaqMan®TNF-α, molecule probe（Cat: Mm 99999068-m1 ,Lot:808338）；</p><p>　　TaqMan®GAPDH

48、, molecule probe（Cat: Mm 9999915-g1 ,Lot:582795）；</p><p>　　TaqMan®MCP-1, molecule probe（Cat: Mm 99999056-m1 ,Lot:789640）；</p><p>　　TaqMan® Gene Expression Master Mix(Cat: 4369016, Lot:

49、：070815）：均購自美國Applied Biosystems公司；</p><p>　　HyClone®Penicilin-Streptomycin solution(Cat:SV30010，Lot:：J100131)：購自美國Thermo Scientific公司；</p><p>　　Nω-Hydroxy-nor-Larginine,Diacetate Salt（nor-

50、NOHA）(Cat.:399275;Lot.No.:D00088455):購自德國EMD Bioscience公司；</p><p>　　Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4（Cat：L2630）購自美國Sigma公司；</p><p>　　NG-Methyl-L-arginine acetate salt,(L-NMMA),N

51、onspecific NOS (Cat:M7033;Lot:029k4051):購自美國Sigma公司；</p><p>　　7-AAD viability staining solution (Cat:00-6993-50;Lot:E00031-1325).購自美國eBioscience 公司；</p><p>　　Invitrogen Molecular probesTM V12883

52、 component A:5(6)-CFDA,SE.mixed isomers.(Cat:V12883;Lot:25955w) 購自美國Invitrogen公司；</p><p>　　Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4 cell culture tested（Cat：L4391；Lot:037k7694）購自美國Sigma公司。</p>

53、<p>　　2.2其它試劑和耗材 </p><p>　　磷酸氫二鈉(Cat:2010011），氯化鉀(Cat:20060111），Na2EDTA (Cat:20080111）等試劑均購自北京益利精細化學品有限公司。</p><p>　　主要試劑及溶液的配制：</p><p>　　1×PBS(0.01mol/L)：</p><

54、;p>　　NaCl8.0 g</p><p><b>　　KCl0.2g</b></p><p>　　Na2HPO4.12H2O3.17g</p><p>　　KH2PO40.2g</p><p>　　去離子水 900ml，</p><p&

55、gt;　　溶解后，定容至1000ml，高壓滅菌，4℃貯存。 </p><p>　　Staining buffer </p><p>　　1×PBS 1000mL</p><p>　　Na2EDTA 7.44g</p><p>　　B

56、SA 5g </p><p>　　以0.22μm濾膜加壓過濾，4℃貯存。</p><p><b>　　完全培養(yǎng)基</b></p><p>　　RPMI1640培養(yǎng)液 40ml</p><p>　　FBS

57、 10ml</p><p>　　雙抗 1萬U/ml</p><p>　　β-巰基乙醇 5µmol/ml </p><p>　　L-Glutamine 2µmol/ml</p><p>　　以5

58、0ml離心管現(xiàn)配現(xiàn)用。</p><p>　　提取RNA所用70％乙醇（以10ml為例）</p><p>　　無水乙醇 7ml</p><p>　　DEPC水 3ml</p><p>　　RLT buffer（現(xiàn)用現(xiàn)配，以100μl為例）</p><

59、p>　　β-巰基乙醇 1μl </p><p>　　RLT溶液 99μl</p><p>　　充分混勻，此為致癌物質(zhì)，在生物安全柜中配置。</p><p><b>　　3．儀器設備</b></p><p>　　流式細胞儀（BD FACS Calibu

60、r） Becton Dickinson and company公司</p><p>　　流式細胞分選儀（BD FACS Aria） Becton Dickinson and company公司</p><p>　　恒溫CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司</p>&l

61、t;p>　　精密電子分析天平（BP221S） 美國scwtorius公司</p><p>　　智能低速離心涂片機（SYIOspin4） 美國Thermo公司</p><p>　　低溫梯度離心機（Mikro 22R） 美國Hettich公司MIKRO22R型</p>&

62、lt;p>　　臺式多用途恒溫離心機 美國Thermo公司</p><p>　　超純水組合系統(tǒng) 美國Millipore公司</p><p>　?。?0℃超低溫冰箱 美國Thermo公司<

63、;/p><p>　　磁力攪拌器（690-5） 美國Nahita公司</p><p>　　高級倒置顯微鏡(AXIOVERT40C) 上海蔡司公司</p><p>　　一次性細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板

64、 美國Costar公司</p><p>　　臺式靈敏pH計 美國Thermo公司</p><p>　　超凈工作臺（SKJH） 上海蘇坤實業(yè)有限公司</p><p>　　高級制冰機（SIM-F124） 日本SANYO公司SIM-F124

65、</p><p>　　智能梯度PCR儀 eppendorf公司</p><p>　　Realtime PCR儀 ABI公司7500</p><p>　　紫外分光光度儀　　　　　　　　　　 Eppendorf Biop

66、photometer公司</p><p>　　Maxi Mix　　　　　　　　　　　　 　 美國Thermo公司</p><p>　　恒溫水浴箱(18007A-ICEQ)　　　　　　　 Barnsteadl labline公司</p><p>　　熒光顯微鏡（BX51）

67、 日本Olympus公司</p><p>　?。?0℃低溫冰箱(3782-ICE) 美國Thermo公司</p><p>　　4℃冰箱　　　　　　　　　　 　 中國海爾公司</p><p>　　紫外線燈（SJC-2）

68、 北京海淀空后高溫復合材料廠</p><p>　　微量移液器　 法國GILSON公司</p><p><b>　　實驗方法</b></p><p>　　第一部分 正常小鼠骨髓初始MDSCs分離和純化</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDS

69、Cs(CD11b+細胞)的免疫磁珠分選</p><p>　　1.1 取小鼠雙下肢股骨和脛骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液； </p><p>　　1.2 CD11b免疫磁珠分選骨髓CD11b+細胞（陽選法）</p><p>　　1.2.1取骨髓單細胞懸液4ml計數(shù)，離心棄上清（1200rpm，5min），按照每10

70、7細胞加90µl staining buffer和10µLCD11b+MicroBeads, 4℃避光孵育15分鐘。</p><p>　　1.2.2 3ml stanining buffer洗一遍（2000rpm，10分鐘），棄上清，加入3ml stanining buffer重懸，按照美天旎免疫磁珠的說明書，使用MACS手動分選CD11b+細胞。</p><p>　　

71、1.2.3 取分選后的CD11b+細胞，加入Percp Cy5.5標記的CD11b抗體和PE標記的Gr1抗體， 4℃避光孵育15分鐘，離心棄上清（1200rpm，5min），加200µl staining buffer 重懸，流式細胞儀分析，檢測分選的CD11b+細胞純度。</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs（CD11b+細胞）形態(tài)學分析</p><p>　　2.1

72、分離純化：取正常小鼠骨髓細胞懸液，方法同前，2 ml stanining buffer洗一遍，用CD11b+MicroBeads陽選CD11b+陽性細胞。</p><p>　　2.2 性質(zhì)鑒定：將FACS Aira分選出的CD11b+細胞取80000個細胞進行離心涂片，Wright-Giemsa染色進行形態(tài)學分析。</p><p>　　2.2.1 將分選到的80000 CD11b+細胞的懸

73、液，離心（1200 rpm，5min），棄上清，加入200 μl staining buffer重懸細胞；</p><p>　　2.2.2組裝離心涂片設備放入離心涂片機；</p><p>　　2.2.3將200μl細胞懸液加入離心涂片管中，室溫離心（750 rpm， 5min）；</p><p>　　2.2.4取出載玻片，靜置5 分鐘晾干；</p>&

74、lt;p>　　2.2.5滴加瑞氏姬姆薩染液A液約6至10滴，輕輕吹勻，使其充分與玻片上的細胞接觸，室溫作用1分鐘；</p><p>　　2.2.6 按1:1體積加入瑞氏姬姆薩染液B液，迅速將吹勻，室溫作用10分鐘；</p><p>　　2.2.7用純凈水沖洗多余染色液，晾干之后即可于油鏡下觀察及拍攝細胞圖像。</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs對C

75、D4+T或CD8+T細胞增殖的體外抑制作用檢測</p><p>　　3.1 抗原非特異性T細胞增殖：</p><p>　　取各組小鼠骨髓細胞分選出CD11b+細胞分別與正常小鼠脾臟初始CD4+或CD8+T細胞共培養(yǎng)，將T細胞以1×105/孔的密度接種到96孔板中，每孔CD11b+細胞與CD4+T細胞比例按1:1、1:2、1:4及1:8培養(yǎng)，檢測骨髓CD11b+細胞抑制淋巴細胞增殖

76、的能力。每孔加1µl DynaBeads CD3/28 T-Activator刺激T細胞活化，正常小鼠脾CD4+或CD8+細胞預先用CFSE標記，培養(yǎng)72小時，用APC標記的CD4或APC標記的CD8抗體染色，7-AAD標記死亡細胞，流式細胞儀分析淋巴細胞增殖情況。增殖指數(shù)計算公式：增殖指數(shù)（Proliferation Index）=共培養(yǎng)的T細胞增殖百分比（ Proliferation Percentage of T cel

77、ls with MDSCs）/陽性對照T細胞增殖百分比 (Proliferation Percentage of T cells without MDSCs）。</p><p>　　3.2免疫磁珠分選CD4+T或CD8+T細胞（陰選法）： </p><p>　　3.2.1制備小鼠脾細胞單細胞懸液，計數(shù)，每107細胞加入40µl的staining buffer和10µl

78、CD4 Anti-Biotin cocktail , 渦旋混勻，4℃避光孵育15分鐘。每107細胞再加入30µl的staining buffer和10µl的CD4 MicroBeads，渦旋混勻，4℃冰箱避光孵育15分鐘；</p><p>　　3.2.2 加入4ml staining buffer洗滌細胞，離心（2000rpm ，10min），棄上清，加500µl staining

79、buffer重懸細胞；</p><p>　　3.2.3根據(jù)分選前總細胞數(shù)目，選擇相應的LS或MS分選柱(LS柱可容納109總細胞；MS柱可容納108總細胞)；</p><p>　　3.2.4 LS或MS分選柱每次加staining buffer洗柱的體積分別為3ml和0.5ml，最終收集目的細胞的洗脫液量分別為5ml和2ml。以LS柱為例：將3ml staining buffer加入分選柱

80、中潤柱，staining buffer流空后加入細胞懸液，同時準備收集目的細胞。取3ml staining buffer洗脫分選柱目的細胞，重復3次。所收集的陰性細胞即CD4＋T或CD8+T細胞，離心（1200rpm，5min）。</p><p>　　3.2.5 加入4ml staining buffer重懸分選的目的細胞，取出10µl稀釋10倍計數(shù)，其余做后續(xù)實驗。</p><p

81、>　　3.3 CD4+T或CD8+T細胞CFSE染色[25,26]：</p><p>　　3.3.1 使用2ml含5%FBS的1×PBS染色液重懸CD4+T細胞；</p><p>　　3.3.2 加0.2µl CFSE（濃度為5µmol/ml），蓋緊流式管，反復快速混勻，室溫避光孵育5分鐘；</p><p>　　3.3.3 加

82、入4ml終止液（含20%FBS的1×PBS），離心（1200rpm， 5min），棄上清，重復一次；</p><p>　　3.3.4 2ml 培養(yǎng)基重懸細胞，離心（1200rpm， 5min），棄上清，計數(shù)后進行后續(xù)實驗。</p><p>　　正常小鼠骨髓MDSCs(CD11b+細胞)對小鼠急性肝衰竭（Acute Hepatic Failure;AHF）模型體內(nèi)免疫抑制作用的檢

83、測</p><p>　　4.1實驗動物及分組</p><p><b>　　4.1.1 動物：</b></p><p>　　Gfi1:GFP基因敲入C57 BL /6J小鼠（Gfi1:GFP-/+），雄性，6～8周，體重約20±1g，加拿大蒙特利爾大學Tarik Moroy教授實驗室贈送，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。PCR法進行基

84、因型鑒定，流式細胞儀檢測GFP進行再次確認。</p><p>　　野生型C57BL/6J小鼠，雄性、6～8周、體重約20±1g購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。</p><p><b>　　4.1.2 分組：</b></p><p>　　對照組：100µl 1×PBS 眼球后注射 10只</p><

85、;p>　　處理組：100µl 細胞懸液（含1×106 MDSCs）眼球后注射10只</p><p>　　4.2 小鼠急性肝衰竭（Acute Hepatic Failure;AHF）造模方法：</p><p>　　用D-半乳糖胺（D-GalN）(400mg/kg)/LPS(0.5mg/kg)劑量造模。D-GalN/LPS混合液調(diào)整體積500µl腹腔注射，腹

86、腔注射的體積25ml/kg計算。</p><p>　　4.3 細胞分離純化及各組的處理方法</p><p>　　按上述1的免疫磁珠方法分離骨髓混合MDSCs (CD11b+ cells), 對照組：100µl 1×PBS 眼球后注射，處理組：100µl （含1×106 MDSCs）眼球后注射，以上兩組注射后2小時制備急性肝衰竭模型。</p>

87、;<p>　　4.4 觀察小鼠12小時生存率，繪制生存曲線</p><p>　　第二部分：正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的分離純化</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的分群和流式分選</p><p>　　無菌操作分離小鼠下肢股骨和脛骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細胞，制備單細胞懸液；</p>

88、<p>　　取106上述的單細胞懸液，100µl stanining buffer重懸，加入Percp Cy5.5標記的CD11b抗體和PE標記的Gr1的抗體，4℃避光孵育15分鐘，2毫升staining buffer 離心（1200rpm,5min），棄上清，200µl staining buffer重懸，流式細胞儀分析和分選。</p><p>　　正常小鼠骨髓MDSCs亞群的

89、形態(tài)學分析</p><p>　　分離純化：制備正常小鼠骨髓單細胞懸液，方法同前，2 ml stanining buffer洗一遍，用抗CD11b microbeads陽選CD11b+陽性細胞即為混合MDSCs。加入Percp-Cy5.5標記的CD11b抗體和PE標記的Gr1抗體，避光孵育15分鐘，2 ml stanining buffer洗一遍，應用流式細胞分選儀從混合MDSCs分選CD11blowGr1low

90、GFP- (M1)、CD11blowGr1lowGFP+（G1）、 CD11blow Gr1high GFP+ (G2)和 CD11bhigh Gr1high GFP+ (G3)四個亞群細胞。</p><p>　　性質(zhì)鑒定：將流式細胞儀（BD FACS Aira）分選出的骨髓初始MDSCs亞群分別取80000個細胞進行離心涂片，Wright-Giemsa染色進行形態(tài)學分析。</p><p>

91、;　　分別將分選后四個亞群的80000個細胞重懸在200µl staining buffer。離心涂片后Wright Giemsa染色后觀察及拍攝細胞圖像（詳細步驟見實驗方法的第一部分）。</p><p>　　第三部分：正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群表型和功能的檢測</p><p>　　1．正常小鼠骨髓初始MDSCs及亞群的比例檢測</p><p>　　取

92、小鼠雙下肢股骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液；</p><p>　　取106上述的單細胞懸液，100µl重懸，使用Percp Cy5.5標記的CD11b抗體和PE標記的Gr1的抗體染色，4℃避光孵育15分鐘，2毫升staining buffer 洗一遍（1200rpm,5min），200µl重懸，流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowjo V5.6.7軟件

93、分析。</p><p>　　2．正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群表型的鑒定</p><p><b>　　2.1 取材及染色</b></p><p>　　取小鼠雙下肢股骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液，離心棄上清（1200rpm ，5min）；取107 細胞染色,均分為10份。</p>

94、<p>　　取上述4份骨髓細胞，分別加入CD11b-Percp Cy5.5、 Gr1-APC和CD124-PE或CD210-PE或TLR-2-PE或TLR-4-PE熒光抗體，4℃避光孵育15分鐘，2ml stanining buffer洗一遍，離心棄上清（1200rpm ，5min），加入200µl stanining buffer流式檢測骨髓初始MDSCs亞群的表型差異。</p><p>

95、;　　取6份骨髓細胞懸液，分別染CD11b-Percp Cy5.5、 Gr1-PE和CD62L-APC、Ly6c -APC、CD204-APC、CD206-APC、CD80-APC、CD86-APC抗體，4℃避光孵育15分鐘，2ml stanining buffer洗一遍，離心棄上清（1200rpm ，5min），加入200µl stanining buffer，用流式細胞儀檢測骨髓naiveMDSCs亞群的表型差異。<

96、/p><p>　　3．正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的體外功能的檢測</p><p>　　3.1 骨髓初始MDSCs不同的亞群對CD4+或CD8+T細胞增殖的影響</p><p>　　抗原非特異性T細胞增殖：分離制備正常小鼠骨髓單細胞懸液，分選出的M1、G1、G2和G3四個亞群細胞分別與正常小鼠脾臟初始CD4+或CD8+T細胞共培養(yǎng)，將T細胞以1×105/孔加

97、至96孔板中，每孔骨髓初始MDSCs亞群細胞與T細胞的比例按1:1、1:2、1:4及1:8培養(yǎng)，每孔加2µl Dynabeads CD3/28 T-Activator刺激T細胞活化，T細胞預先用CFSE標記；培養(yǎng)72小時，分別用APC標記的CD4或CD8抗體染色，7-AAD標記死亡細胞，流式細胞儀檢測和分析M1、G1、G2和G3細胞抑制淋巴細胞增殖的能力。增殖指數(shù)計算公式見實驗方法的第一部分。</p><p

98、>　　3.2免疫磁珠分選CD4+T或CD8+T細胞（陰選法）： </p><p>　　3.2.1 制備正常小鼠脾細胞單細胞懸液，分別應用德國美天旎公司的免疫磁珠陰選試劑盒分選CD4+或CD8+T細胞，（詳細方法見第一部分）。</p><p>　　3.2.2 4ml staining buffer重懸分選出的細胞，取出10µl計數(shù)，其余做后續(xù)實驗。</p>&

99、lt;p>　　3.3 CD4+T或CD8+T細胞CFSE染色：</p><p>　　將分選后的CD4+T或CD8+T細胞用CFSE標記后計數(shù)，進行后續(xù)實驗（詳細方法見第一部分）。</p><p>　　第四部分 正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群對CD4+T和CD8+T細胞增殖抑制作用機制的初步探討</p><p>　　1．正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的細胞因子

100、及Arg?、NOS2兩種酶實時定量PCR檢測</p><p>　　分選出各組小鼠骨髓M1、G1、G2和G3亞群細胞進行實時定量PCR法（Real-time PCR），從mRNA表達水平檢測IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1以及ArgI、NOS2在初始MDSCs不同亞群細胞中的表達。探討M1、G1、G2和G3亞群細胞抑制CD4+T或CD8+T細胞免疫反應的機制。</p>

101、;<p>　　Realtime-PCR實驗：</p><p>　　1.1 純化細胞總RNA（德國QiaGen公司的RNeasy Mini Kit）</p><p>　　1.1.2 將流式細胞分選儀分選的骨髓初始MDSCs四個亞群細胞用4ml PBS 重懸，離心（1200 rpm，5min），棄上清；</p><p>　　1.1.3 加350 μl RL

102、T buffer細胞裂解液裂解細胞，反復吹打至細胞懸液透亮；</p><p>　　1.1.4 將裂解后的細胞懸液加至DNA eliminator spin column中，高速離心（13000 rpm ，30s）；</p><p>　　1.1.5 棄DNA eliminator spin column，在濾液中加350μl 70%酒精（RNase-free），用移液器輕輕吹勻；</p

103、><p>　　1.1.6 將上述700µl濾液加至RNase-free spin column，高速離心（13000rpm 15s），棄濾液；</p><p>　　1.1.7 向RNase-free spin column中加700 μl buffer RW1洗滌RNA，高速離心（13000 rpm 15s），棄濾液；</p><p>　　1.1.8 向RNa

104、se-free spin column中加500μl buffer RPE洗滌RNA，高速離心（13000 rpm 15s），棄濾液；</p><p>　　1.1.9 重復步驟7。高速離心（13000 rpm，2 min），洗滌RNA；</p><p>　　1.1.10將RNase-free spin column，放置在采集管中加RNase-free water 30μl 溶解RNA，高

105、速離心（13000 rpm，1min），收集RNA溶液；</p><p>　　1.1.11取1μl RNA溶液用RNase-free water稀釋50倍，使用紫外分光光度計測定RNA含量。方法如下：比色杯中加入50 μl RNase-free water校正紫外分光光度計歸零，測定RNA樣品的OD 260/OD 280,計算RNA的濃度（μg/ml），以OD260/OD280判斷RNA樣品中有無蛋白質(zhì)等物質(zhì)混雜

106、。提取的RNA純度用A260/A280的值表示，比值再1.8～2.0范圍內(nèi)為RNA，方可進行后續(xù)實驗。</p><p>　　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（Reverse Transcription-PCR ；RT-PCR）（使用美國ABI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）</p><p>　　1.2.1 每20 μl反應體系加總RNA量必須大于等于2 µg；</p><p>　　

107、1.2.2 在無RNA酶的操作室進行，冰上加樣，反應體系如下：</p><p>　　1.2.3 使用梯度PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，條件如下：</p><p>　　1.3 實時熒光定量-PCR（Realtime-PCR）</p><p>　　1.3.1 Realtime-PCR反應體系（反應體積20μl）如下：</p><p>　　1.3.2

108、使用美國ABI 7500 Realtime-PCR儀進行反應，反應條件如下：</p><p>　　1.4 ABI SDS 7500 software分析結果。</p><p>　　2．精氨酸激酶I（Arg?）、一氧化氮合酶2（NOS2）和一氧化氮合酶（NOS）抑制劑阻斷骨髓初始MDSCs亞群對T細胞增殖抑制作用</p><p>　　2.1抗原特異性T細胞增殖：&l

109、t;/p><p>　　制備正常小鼠骨髓單細胞懸液，方法同第一部分。分選出M1、G1、G2和G3四個亞群細胞與正常小鼠脾臟初始CD4+T或CD8+T細胞在96孔板中共培養(yǎng)，T細胞每孔1×105細胞，每孔骨髓初始MDSCs亞群細胞與T細胞的培養(yǎng)比例為1:1，每一孔加入2µl DynaBeads CD3/28 T-Activator刺激T細胞活化，正常小鼠脾淋巴細胞預先以CFSE標記以觀測其增殖情況，檢