免疫抑制劑他克莫司對(duì)髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞的影響.pdf

1、前言：免疫抑制劑他克莫司(FK506)自從1989年被美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院首次用于臨床以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用在腎、肝、心、肺、小腸等移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療。作為一種新開(kāi)發(fā)的，更為安全、有效的免疫抑制劑，因其作用強(qiáng)，不良反應(yīng)較少，目前已經(jīng)成為器官移植后的首選免疫抑制劑。普遍認(rèn)為，F(xiàn)K506抗排斥反應(yīng)的機(jī)制是通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)胞漿蛋白FK蛋白(FKBP)結(jié)合形成FK506-FKBP復(fù)合物，該復(fù)合物與鈣神經(jīng)堿有高度親合性，能明顯抑制磷酯酶活性

2、，抑制鈣離子內(nèi)流，從而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降，使鈣離子依賴的T細(xì)胞受體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化和IL-2的分泌受到抑制，故以往的研究多集中在FK506對(duì)T細(xì)胞的直接作用上。 近年來(lái)，隨著器官移植的發(fā)展和對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)研究的深入，發(fā)現(xiàn)DC在識(shí)別自身和外來(lái)抗原、誘導(dǎo)宿主對(duì)移植物的免疫反應(yīng)以及移植排斥和移植耐受平衡的雙向調(diào)節(jié)等移植免疫中起著重要作用。其中不成熟DC由于缺乏CD80、CD86等第二信號(hào)的表達(dá)，無(wú)法激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此在

3、誘導(dǎo)移植免疫耐受、延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間方面有著十分重要的地位。故不成熟DC與移植免疫耐受的關(guān)系也成為近年的研究熱點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上還提出了耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞的概念，即由于缺乏B7等共刺激分子，不能活化T細(xì)胞，反而使T細(xì)胞功能失活，誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受。 FK506作為移植術(shù)后防止和治療排異反應(yīng)的重要免疫抑制劑之一，其強(qiáng)大的免疫抑制作用是否也跟它直接作用于DC，使其具有不成熟DC或是類似耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞的性狀有關(guān)?國(guó)外曾有報(bào)道，F(xiàn)K506除抑制

4、T細(xì)胞活化外，還影響人外周血來(lái)源的DC成熟。然而，有關(guān)FK506對(duì)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)的作用的研究較少。為此，我們研究了小鼠BMDC的分化過(guò)程中，F(xiàn)K506對(duì)其表面分子MHCⅡ類分子、CD80、CD86和近年發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員B7-H1、B7-DC表達(dá)的影響，以及由此產(chǎn)生的DC功能學(xué)的變化，以期探討FK506抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)以外的免疫抑制機(jī)制，并為后續(xù)的DC回輸在器官移植中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：觀察他克莫司

5、(FK506)對(duì)小鼠髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)的影響，探討他克莫司(FK506)抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)以外的免疫抑制機(jī)制，并為后續(xù)的DC回輸在器官移植中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：一、提取和培養(yǎng)髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞：6-8周C57BL/6小鼠，取股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，獲得骨髓細(xì)胞，將骨髓細(xì)胞放入含10％胎牛血清，GM-CSF4ng·mL-1，IL-42ng·mL-1的1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，獲得髓源性樹(shù)突狀

6、細(xì)胞。根據(jù)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度的FK506，將細(xì)胞分成4個(gè)組。A組：陰性對(duì)照，細(xì)胞未予任何處理；B組：細(xì)胞培養(yǎng)第一天加FK5060ng·mL-1，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前18小時(shí)加入DC成熟誘導(dǎo)劑、炎性因子LPS0.1μg·mL-1；C組：細(xì)胞培養(yǎng)第一天加FK5061ng·mL-1，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前18小時(shí)加LPS0.1μg·mL-1；D組：細(xì)胞培養(yǎng)第一天加FK50610ng·mL-1，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前18小時(shí)加LPS0.1μg·mL-1。

7、 二、FK506對(duì)DC共刺激分子表達(dá)的影響：收集培養(yǎng)完全的DC，制成細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，加入不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體：CD11c/MHCⅡ、CD11c/CD80、CD11c/CD86、CD11c/B7-H1、CD11c/B7-DC，避光反應(yīng)20min，洗滌，使用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。 三、FK506對(duì)DC分泌細(xì)胞因子水平的影響：使用ELISA法檢測(cè)A、B、C、D組細(xì)胞分泌IL-12P70、TNF-α、IL-10等細(xì)胞

8、因子水平的變化。 四、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)BMDC刺激同種T細(xì)胞增殖能力：BALB/C小鼠，無(wú)菌條件下取脾，將脾臟組織碾碎，獲取細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，獲得的未貼壁細(xì)胞即為T細(xì)胞，MLR中的反應(yīng)細(xì)胞。分別收集培養(yǎng)結(jié)束的A、B、C、D組細(xì)胞，絲裂霉素C滅活，作為刺激細(xì)胞。反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞各100μL，加入無(wú)菌96孔板的1孔，作為反應(yīng)體系。使得反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞以不同細(xì)胞比

9、(100：1，10：1，1：1)進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，培養(yǎng)結(jié)束前18h，加入3H-TdR1μCi/孔，閃爍記數(shù)儀檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞的3H-TdR摻入。 五、觀察MLR中FK506對(duì)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響和對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)情況：ELISA法檢測(cè)T細(xì)胞分泌IFN-γ水平，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞CD4/CD25陽(yáng)性率。 六、FK506對(duì)BMDCB7-DC和B7-H1mRNA水平表達(dá)的影響：用半

10、定量RT-PCR測(cè)定其表達(dá)。Trizol常規(guī)提取BMDC總RNA，經(jīng)核酸紫外分析儀檢測(cè)，根據(jù)OD260和OD280值，計(jì)算樣品中RNA純度和含量。每個(gè)樣本取總RNA2μg，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物后，以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳后，用數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng)成像、條帶密度掃描，用同樣本和內(nèi)參照條帶的密度進(jìn)行比較(樣本密度/內(nèi)參條帶密度)，進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果：一、FK506對(duì)DC共刺

11、激分子表達(dá)的影響：FK506明顯抑制DC共刺激分子CD80、CD86表達(dá)，促進(jìn)抑制性分子B7-DC表達(dá)。與B組76.61±9.27％、72.99±4.75％比，F(xiàn)K506處理的C、D組細(xì)胞CD80、CD86表達(dá)下降至37.57±2.25％、43.22±6.60％和35.81±1.10％、37.46±0.39％，有顯著性差異(P＜0.05)。C、D組細(xì)胞B7-DC表達(dá)量為49.97±2.11％和57.71±1.71％，與B組30.73±1

12、.65％比較，差異顯著(P＜0.05)。而MHCⅡ類分子和B7-H1表達(dá)無(wú)變化。 二、FK506對(duì)DC分泌細(xì)胞因子水平的影響：FK506抑制DC分泌IL-12P70，C、D組分泌水平為250.95±87.01pg·mL-1和200.26±26.32pg·mL-1，與B組687.67±96.1pg·mL-1比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。10ng·mL-1的FK506不但促進(jìn)DC分泌IL-10，還能有效抑制DC分泌TNF-

13、α。IL-10水平由356.18±55.29pg·mL-1上升至752.20±112.76pg·mL-1，而TNF-α則從1815.7±96.1pg·mL-1下降到1309.74±275.04pg·mL-1，差異顯著(P＜0.05)。 三、FK506對(duì)DC刺激同種T細(xì)胞增殖能力的影響：FK506可以明顯的抑制DC對(duì)同種T細(xì)胞增殖能力的刺激作用。并且，在反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞為1：1和10：1時(shí)，C組與D組對(duì)T細(xì)胞增殖能力的抑制作用與

14、FK506均呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)。 四、MLR中FK506對(duì)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)情況：與FK506作用的C組和D組DC混合后，T細(xì)胞的IFN-γ分泌量呈劑量依賴關(guān)系的從267.46±83.49pg·mL-1下降至180.4±66.39pg·mL-1和136.29±80.55pg·mL-1(P＜0.05)。FK506并未誘導(dǎo)出CD4/CD25雙陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 五、FK506對(duì)BMDCB7-D

15、C和B7-H1mRNA水平表達(dá)的影響：FK506明顯促進(jìn)C組和D組B7-DC表達(dá)水平增高，樣本密度：內(nèi)參條帶密度比值顯示C組和D組B7-DC相對(duì)表達(dá)量為0.617±0.047和0.661±0.059，而B(niǎo)組僅為0.416±0.103(P＜0.05)。但對(duì)于B7-H1，A、B、C、D組間表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論：免疫抑制劑FK506，尤其是作用濃度為10ng·mL-1的FK506，能在BMDC分化過(guò)程中誘導(dǎo)其分化成一