淫羊藿苷對免疫抑制小鼠免疫和造血功能影響的實驗研究.pdf

1、目的:研究中藥淫羊藿單體成分淫羊藿苷(ICA)對免疫抑制小鼠免疫和造血功能影響,進一步探討其免疫學調(diào)節(jié)機制,為ICA作為一種免疫調(diào)節(jié)劑及化療保護劑應(yīng)用于臨床提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1將60只7-8周齡C57BL/6j小鼠隨機分為6組,建立小鼠免疫抑制模型[1],其中實驗組、陽性對照組和模型對照組均于腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy,300mg/kg)；第二天,實驗組通過灌胃方式給予不同劑量ICA(150、80、4

2、0mg/kg.day),陽性對照組小鼠經(jīng)腹腔注射參芪扶正注射液,(1ml/day,0.4mg/ml),模型對照組小鼠給予等量生理鹽水(NS),連續(xù)給藥10d,正常對照組小鼠不做任何處理,正常飼養(yǎng)。每天觀察小鼠生存狀態(tài),于末次給藥12小時后引頸處死小鼠,分離胸腺、脾、腹腔巨噬細胞、骨髓、外周血用于實驗,稱量胸腺和脾臟的重量,計算胸腺指數(shù)(TI)和脾臟指數(shù)(SI)。
　　 2采用HE染色光鏡下觀察小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)變化。
　　

3、 3采用MTT法檢測小鼠脾淋巴細胞的增殖反應(yīng)。
　　 4采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測腹腔巨噬細胞、脾NK細胞、CTL細胞的殺傷能力。
　　 5采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-12和脾淋巴細胞產(chǎn)生TNF-α的水平。
　　 6采用流式細胞術(shù)檢測脾臟細胞中T細胞亞群的變化。
　　 7采用瑞氏-姬姆薩染色觀察骨髓和外周血細胞形態(tài)變化。
　　 8采用全自動血細胞

4、計數(shù)儀檢測外周血血細胞計數(shù)的變化。
　　 9光鏡下計數(shù)小鼠單根股骨骨髓細胞的數(shù)量。
　　 結(jié)果:
　　 1成功建立了環(huán)磷酰胺誘導的小鼠免疫抑制模型[1],模型對照組小鼠活動能力差,進食飲水狀況不佳,在第6天時有一只死亡；正常對照組、陽性對照組、實驗組小鼠的活動、進食、飲水均正?；钴S,全部存活。模型對照組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯低于正常對照組,ICA各劑量均可使小鼠脾臟指數(shù)升高,與模型對照組相比有顯著性差異。IC

5、A高(150mg/kg·day)、低(40 mg/kg·day)劑量組提高了小鼠胸腺指數(shù),與模型對照組相比有統(tǒng)計學意義,但均未達到正常組水平。
　　 2模型對照組小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,胸腺周圍出現(xiàn)脂肪細胞變性和壞死,低劑量(40mg/kg)ICA處理組小鼠胸腺組織仍可見部分脂肪組織填充,但未見明顯壞死組織。參芪扶正注射液和中、高劑量ICA處理組小鼠胸腺組織形態(tài)正常,未見明顯改變。
　　 3 ConA可明顯促進高(

6、150mg/kg·day)、中劑量(80mg/kg·day)ICA處理組和參芪扶正注射液處理組小鼠脾臟T細胞增殖反應(yīng),與模型對照組相比,有顯著性差異(P<0.05)；LPS可促進高劑量ICA組小鼠B細胞的增殖反應(yīng),與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05),中、低劑量ICA處理后,對小鼠脾B細胞增殖反應(yīng)無顯著影響(P>0.05)。
　　 4與正常對照組小鼠相比,模型對照組小鼠腹腔巨噬細胞、NK細胞和CTL細胞的殺傷活性顯著降低

7、(P<0.01),不同濃度ICA均能提高巨噬細胞、NK細胞和CTL細胞的殺傷活性,與模型對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)；高濃度ICA處理組和陽性對照組小鼠巨噬細胞、NK細胞和CTL細胞的殺傷活性與正常對照組相比,無明顯差異(P>0.05)。
　　 5與正常組小鼠相比,模型組小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-12和脾細胞產(chǎn)生TNF-α的水平明顯降低(P<0.01),經(jīng)ICA處理10天后,實驗組小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TN

8、F-α、IL-12和脾細胞產(chǎn)生TNF-α的水平與陽性對照組及正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　 6與正常組比較,模型對照組小鼠CD3+T細胞和NKT細胞比例明顯降低。ICA灌胃治療小鼠10天后,與模型對照組相比,小鼠脾淋巴細胞中CD3+T細胞和NKT(CD3+NK1.1)細胞百分比均顯著升高(P<0.01),其中ICA高、低濃度組小鼠CD3+T細胞百分比高于正常對照組(P<0.01)。ICA高、中濃度組小鼠NKT

9、細胞比例高于正常對照組(P<0.01)。
　　 7小鼠骨髓和外周血涂片可見,正常組小鼠骨髓涂片中有核細胞增生活躍,模型對照組小鼠骨髓呈現(xiàn)造血抑制狀態(tài)。經(jīng)ICA處理后,實驗組小鼠骨髓涂片和外周血涂片中均可見骨髓抑制狀態(tài)有所改善。
　　 8外周血血細胞計數(shù)結(jié)果顯示:模型對照組小鼠WBC、RBC和PLT較正常對照組明顯降低(P<0.01),而高、中、低濃度ICA均可明顯提高實驗組小鼠外周血WBC、RBC和PLT數(shù)量。
　

10、　 9于小鼠腹腔注射Cy10天后,模型對照組小鼠單根股骨骨髓細胞數(shù)量為7.03×106/femur,與正常對照組小鼠(10.36×106/femur)相比明顯降低,差異有顯著性(P<0.01),經(jīng)高、中濃度ICA和參芪扶正注射液治療后,小鼠單根股骨骨髓細胞數(shù)量與正常對照組相比,無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1 ICA對免疫抑制小鼠的免疫器官具有很好的保護作用。
　　 2 ICA可顯著刺激小

11、鼠脾T、B細胞的增殖,增強腹腔巨噬細胞、NK和CTL細胞的殺傷能力,顯著增加免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-12和脾細胞產(chǎn)生TNF-α等細胞因子的含量,上調(diào)小鼠脾淋巴細胞中CD3+T細胞和NKT(CD3+NK1.1)細胞的比例,可明顯恢復免疫抑制小鼠細胞免疫和體液免疫功能。
　　 3 ICA可顯著改善免疫抑制小鼠的骨髓造血狀態(tài),提高骨髓細胞和外周血細胞數(shù)量,可明顯恢復和改善造血功能。
　　 4 ICA可顯著