野生甲魚對免疫抑制造模小鼠的影響研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　野生甲魚對免疫抑制造模小鼠的影響研究</p><p><b>　　摘 要</b>&

2、lt;/p><p>　　本文采用地塞米松磷酸鈉注射液（0.25mL/只）注射小鼠構(gòu)建免疫抑制模型，飼喂野生甲魚、溫室甲魚和普通飼料后，檢測小鼠體重、脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、MDA活性、吞噬指數(shù)等生理生化指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗小鼠在試驗期間生長發(fā)育未見異常，初、末體重各組間均不顯著；小鼠不同性別雌雄間臟器系數(shù)比較，各組間脾臟系數(shù)差異極顯著（P<0.01），而胸腺系數(shù)差異不顯著（P>0.05）；肝組織MDA含量測定結(jié)

3、果顯示，野生甲魚對照組均低于顆粒飼料對照組和溫室甲魚對照組，但差異不顯著，表明野生甲魚一定程度上能夠減少肝組織中MDA含量，減少細胞受自由基的攻擊；碳廓清實驗測定結(jié)果顯示，無論是兩種性別還是單一性別小鼠比較，組間均無顯著性差異。本實驗通過研究野生甲魚對免疫抑制造模小鼠的影響，來說明和證實野生甲魚的營養(yǎng)價值和保健功效。</p><p>　　關(guān)鍵詞：免疫抑制模型；野生甲魚；營養(yǎng)價值；保健功效</p>&

4、lt;p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Immune suppression model was build by injection of Sodium Phosphate into mice (0.25mL per mice). After feeding the following three feedstuffs: wild-type soft-sh

5、elled turtle, domesticated turtle and normal diet, the physiological and biochemical parameters: body weight, organ coefficient, thymus coefficient, liver MDA activity and phagocytic index were detected. The results show

6、ed that during trail, the growth is normal and no significant difference between initial bodyweight and final weight was</p><p>　　Key words: Immunosuppressant model; turtle; dietary value; health claim</p

7、><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料和方法2</b></p><p>　　2.1 實驗材料2</p><p>　　2.1.1 試驗甲魚及飼喂料2</p>

8、;<p>　　2.1.2 實驗動物2</p><p>　　2.1.3 實驗試劑2</p><p>　　2.1.4 實驗設(shè)備2</p><p>　　2.2 實驗方法3</p><p>　　2.2.1 飼喂小鼠甲魚飼料制備3</p><p>　　2.2.2 實驗動物分組處理3</p>

9、<p>　　2.2.3 免疫抑制造模小鼠構(gòu)建3</p><p>　　2.2.4 小鼠免疫指標測定方法3</p><p>　　2.2.5 處理分析5</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析5</b></p><p>　　3.1 野生甲魚對小鼠生長發(fā)育的影響5</p><p>

10、;　　3.2 脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)測定7</p><p>　　3.3 腹腔巨噬細胞功能影響8</p><p>　　3.4 MDA含量的測定8</p><p>　　3.5 小鼠碳廓清實驗的影響9</p><p>　　4 結(jié)論和展望10</p><p><b>　　參考文獻11</b><

11、;/p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　中華鱉（Trionyx Sinensis），又名“中國鱉”，俗稱甲魚、團魚、水魚、腳魚、王八、神守等。它是一種珍貴的、經(jīng)濟價值很高的水生動物。</p><p>　　據(jù)測定，100克鱉肉中蛋白質(zhì)含量達16.5克。此外，還含有豐富的鈣、磷、鐵、硫胺素、核黃素、尼克酸、維生素A等多種營養(yǎng)成

12、分。鱉蛋白的氨基酸不但含量高，而且種類齊全，人體所需的8種必須氨基酸占其氨基酸總量的60%[1]。同時朱秋華等[2]通過比較仿生鱉與溫室鱉的營養(yǎng)成分，結(jié)果表明仿生鱉的粗蛋白含量極顯著地高于溫室鱉，仿生鱉肌肉中9種必需氨基酸的含量和鮮味氨基酸的含量都高于溫室鱉。</p><p>　　中華鱉的肉及其提取物還能有效地預防和抑制肝癌、胃癌、急性淋巴性白血病，并用于防治因放療、化療引起的虛弱、貧血、白細胞減少等癥。據(jù)《本草

13、綱目》記載：鱉肉可治久痢、虛勞、腳氣等?。击M甲主治骨蒸勞熱、陰虛風動、肝脾腫大和肝硬化等；鱉血外敷可治顏面神經(jīng)麻痹、小兒疳積潮熱，兌酒可治婦女血癆；鱉卵能治久瀉久?。击M膽汁有治痔瘺等功效。鱉頭干制入藥稱“鱉首”，可治脫肛、漏瘡等。用活鱉、鱉甲或鱉甲膠做原料配制的中成藥有二龍膏、烏雞白風丸、化癥回生丹、史國公酒、鱉甲煎丸等。</p><p>　　諸學良[3]等根據(jù)“保健食品功能學評價程序和檢驗方法”，做了小白鼠動物

14、喂養(yǎng)試驗，以類推對人體功能作用。試驗結(jié)果可以認為中華鱉膠囊有抗疲勞作用，有免疫調(diào)節(jié)作用和有改善性功能作用。另外王慧銘等[4]等研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲多糖（trionyx sinensis polysac-charides，TSP）能顯著對抗免疫抑制劑引起的小鼠免疫器官萎縮，對免疫器官具有保護作用，表明TSP可改善免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能。TSP可顯著提高小鼠血清半數(shù)溶血值、外周血T淋巴細胞CD4亞群的比例，可顯著增強小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)，表

15、明TSP可顯著增強免疫抑制小鼠體液免疫和細胞免疫功能。</p><p>　　目前腫瘤是嚴重危害人類健康與生命的疾病之一，癌癥患者本身機體抵抗力就低，經(jīng)過放療和化療以后機體抵抗力就更低，影響到患者的康復和預后，中華鱉具有抗腫瘤作用。潘宏銘等[5]通過測定荷瘤小鼠的瘤重、抑瘤率及瘤體比觀察鱉甲多糖對腫瘤生長的影響，結(jié)果表明鱉甲多糖能明顯減小S180荷瘤小鼠的瘤重和瘤體比（P<0.05），能明顯抑制腫瘤的生長（P

16、<0.05），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的平均抑瘤率分別為30%、37%、45%。甲魚提取液對內(nèi)瘤S180瘤株引發(fā)的實體瘤、艾氏腹水癌瘤株引發(fā)的實體瘤和腹水瘤均有抑制作用，并能延長載瘤小鼠的壽命[6-7]。因此本實驗從免疫學的角度，通過野生甲魚對免疫抑制造模小鼠的影響研究，為中華鱉的營養(yǎng)、保健價值的研究和中華鱉配合飼料的研制提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，并促進中華鱉養(yǎng)殖的發(fā)展。</p><p><b>　　2 材料和

17、方法</b></p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　2.1.1 試驗甲魚及飼喂料</p><p>　　野生甲魚購于寧波明鳳生態(tài)甲魚場，4年以上野生放養(yǎng)甲魚；溫室養(yǎng)殖甲魚購于寧波東裕菜場2年生500g左右商品甲魚；小鼠飼喂顆粒由浙江省杭州市實驗動物養(yǎng)殖中心提供專用小鼠料。</p>&l

18、t;p>　　2.1.2 實驗動物</p><p>　　試驗小鼠購于浙江省杭州市實驗動物養(yǎng)殖中心，20日齡的健康小白鼠（雌雄各半）。</p><p>　　2.1.3 實驗試劑</p><p>　　實驗所用試劑見下表1。</p><p>　　表1 實驗主要試劑一覽表</p><p>　　2.1.4 實驗設(shè)備<

19、/p><p>　　實驗所用設(shè)備見下表2。</p><p>　　表2 實驗主要儀器設(shè)備一覽表</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 飼喂小鼠甲魚飼料制備</p><p>　　野生及溫室甲魚顆粒飼料的制備，采用甲魚糜與小鼠顆粒飼料混勻后，絞肉機制成顆料狀。

20、用剪刀剔除甲魚背、腹大甲板，帶骨剪碎置于組織搗碎機中碾成糊狀，按10%量添加裹小鼠飼料及少量面粉，于絞肉機中制成軟顆粒狀，冰箱中冷凍保藏。</p><p>　　2.2.2 實驗動物分組處理</p><p>　　將68只20g左右初體重的小白鼠用小鼠顆粒飼料預養(yǎng)二周后，雌雄隨機分成6個處理組，每組雌雄各半。即顆粒飼料對照組（小鼠顆粒飼料），免疫抑制組（小鼠顆粒飼料），溫室甲魚免疫抑制組（溫室

21、甲魚顆粒料），野生甲魚免疫抑制組（野生甲魚顆粒料），溫室甲魚對照組（溫室甲魚顆粒料）和野生甲魚對照組（野生甲魚顆粒料）。并于實驗前空腹稱取記錄各組小白鼠體重[8]。</p><p>　　2.2.3 免疫抑制造模小鼠構(gòu)建</p><p>　　免疫抑制組實驗小鼠采用每天皮下注射醫(yī)用地塞米松磷酸鈉注射液（1mg/mL）0.25mL/只，構(gòu)建免疫抑制組模型；對照組同法采用0.9%生理鹽水代替地塞米

22、松液處理。</p><p>　　2.2.4 小鼠免疫指標測定方法</p><p>　　2.2.4.1 脾臟系數(shù)、脾腺系數(shù)和體增重</p><p>　　實驗小鼠稱重后處死，分離脾臟、胸腺，剔除臟器表面脂肪、吸凈表面血跡后用電子天平稱重，并進行小鼠脾臟系數(shù)胸腺系數(shù)和體增重的測定。</p><p>　　脾臟系數(shù)（mg/g）＝脾臟重量（mg）/體重（

23、g）；</p><p>　　胸腺系數(shù)（mg/g）＝胸腺重量（mg）/體重（g）；</p><p>　　體增重（g）＝給藥后體重（g）－給藥前體重（g）。</p><p>　　2.2.4.2 腹腔巨噬細胞功能影響實驗</p><p>　　瑞氏染色液配制：瑞氏色素0.1g，甲醇60mL用乳缽研磨溶解。</p><p>　　

24、瑞氏-Giemsa染液配制：瑞氏染液5mL，Giemsa染液1mL，蒸餾水6mL混勻。</p><p>　　腹腔巨噬細胞統(tǒng)計：將小鼠以頸椎脫臼法處死，剖開腹腔，用不帶針頭注射器吸取小白鼠腹腔液，進行涂片，每只小鼠涂2片。自然晾干后，用瑞氏-Giemsa染液染色，鏡檢，在顯微鏡高倍鏡下計數(shù)巨噬細胞吞噬百分率[9]。</p><p>　　吞噬百分率=（吞噬雞紅細胞的巨噬細胞總數(shù)/觀察到的巨噬細

25、胞總數(shù)）×100%。</p><p>　　2.2.4.3 MDA活性的測定</p><p>　　采用MDA試劑盒法測定MDA活性，該試劑盒需保存在冰箱中。試劑一在低溫下會凝固，在使用前需用25~37℃水浴加溫使其溶解至透明狀方可使用。試劑二在使用前需加如340mL蒸餾水混勻。試劑三在使用前將其融化在90~100℃的60mL的蒸餾水中，溶解時可適當加熱，充分溶解后若體積不及60mL

26、可再補加至60mL，再加入60mL冰醋酸，混勻后使用。標準品：10nmol/mL四乙氧基丙烷5mL/瓶。</p><p>　　樣品處理：將實驗小鼠處死后稱取肝臟，用潔凈的實驗剪刀剪取0.5g左右的肝置于離心管內(nèi)并剪碎，用電動勻漿機進行研磨，加入冷藏條件下9.5mL的生理鹽水進行稀釋，將制備好的5%用3000r/min離心10-15min，取上清液進行MDA含量的測定。</p><p>　　

27、MDA含量測定：將表3的樣品用旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，然后3500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10min，取上清液，于532nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。</p><p>　　組織中MDA含量計算公式：</p><p><b>　　表3 樣品配制</b></p><p&

28、gt;　　2.2.4.4 碳廓清試驗</p><p>　　小鼠尾靜脈注射1：3稀釋的印度墨水，按0.1mL/10g劑量計算，待墨汁注入立即計時，于注入墨汁后2、10min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20µL，將其加到2mL 0.1%Na2CO3溶液中，用721分光光度計600nm波長處測OD值。以廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（a）表示小鼠碳廓清能力。</p><p>　　K=（lgOD1-l

29、gOD2）/（t2-t1）</p><p>　　吞噬指數(shù)a=×K1/3</p><p>　　2.2.5 處理分析</p><p>　　本實驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 野生甲魚對小鼠生長發(fā)育的影響<

30、;/p><p>　　實驗小鼠飼喂顆粒飼料及甲魚顆粒料2個月后各組之間未出現(xiàn)特殊情況，其中免疫抑制組出現(xiàn)一只小鼠死亡，這也許是因為小鼠本身的免疫力差，在注射了免疫抑制劑后，免疫力下降導致死亡。根據(jù)性別的差異，雌性小鼠比雄性小鼠消瘦。結(jié)果如表4、5所示各組小鼠初、末體重的相差不顯著（P>0.05）。</p><p>　　表4 飼喂雄性小鼠體重變化的情況</p><p&g

31、t;<b>　　續(xù)表4</b></p><p>　　表5 飼喂雌性小鼠體重變化的情況</p><p>　　由表4、5，圖1、2可知，小鼠在打了免疫抑制劑地塞米松磷酸鈉注射液后，體重明顯下降，這是因為抑制劑對小鼠產(chǎn)生免疫效應(yīng)，使小鼠的體質(zhì)下降，繼而小鼠產(chǎn)生食欲下降，身體抵抗力下降等現(xiàn)象。另外，注射生理鹽水的小鼠比打免疫抑制劑的小鼠顯得活潑、好動，而且小鼠的體重呈現(xiàn)增長

32、的趨勢。也許是因為喂食的時間短，飼喂甲魚的小鼠的體重與飼喂顆粒飼料的小鼠的體重無明顯的差異。還有就是小鼠體重的變化不是單因素控制的，是由攝食量、活動量、環(huán)境等因素共同作用。由于每只小鼠每天攝食量存在一定的差異，根據(jù)對小鼠喂食情況觀察，每籠小鼠每天給予等量的食物，發(fā)現(xiàn)其攝食量基本相近，故將攝食量造成的體重差異忽略不計。</p><p>　　圖1 實驗雄性小鼠體重變化情況</p><p>　　

33、圖2 實驗雌性小鼠體重變化情況</p><p>　　3.2 脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)測定</p><p>　　脾臟是機體最大的外周性免疫器官，是T、B淋巴細胞定居和對抗原刺激進行免疫應(yīng)答的場所。因此，測定脾臟系數(shù)的變化能直接反映脾臟細胞的結(jié)構(gòu)和功能的狀態(tài)。而胸腺和脾臟是機體的主要免疫器官，免疫抑制劑可使胸腺、脾臟萎縮；免疫增強劑可使胸腺、脾臟增重。因此，胸腺和脾臟可作為觀察野生鱉對小白鼠免疫功能

34、影響的指標之一。</p><p>　　表6 各組小鼠免疫器官重量指數(shù)的變化</p><p>　　注：同列數(shù)據(jù)肩標小寫字母相同或無字母表示差異不顯著（P>0.05），小寫字母完全不同表示差異顯著（P<0.05），大寫字母完全不同表示差異極顯著（P<0.01）。</p><p>　　由表6可見，溫室甲魚和野生甲魚對照組小鼠的脾臟系數(shù)明顯大于注射地塞米

35、松磷酸鈉注射液免疫抑制劑小鼠的脾臟系數(shù)，同時也大于單一用顆粒飼料喂養(yǎng)的小鼠，結(jié)果表明甲魚能促進小鼠的生長發(fā)育。而小鼠的各組胸腺系數(shù)之間的差異均顯著。</p><p>　　3.3 腹腔巨噬細胞功能影響</p><p>　　在機體的免疫過程中，巨噬細胞是體內(nèi)重要的抗原遞呈細胞[10]，作為主要的免疫細胞之一，具有噬菌、殺菌、清除機體內(nèi)已損傷和衰老的細胞的功能。</p><p

36、>　　圖3 小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響（吞噬百分數(shù)）</p><p>　　由圖3結(jié)果顯示，與顆粒飼料對照組比較，溫室甲魚對照組和野生甲魚對照組的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率明顯大。而野生甲魚免疫抑制組的吞噬能力比溫室甲魚免疫抑制組強，這是因為，野生甲魚比溫室鱉營養(yǎng)價值高，具有良好的保健功效。這與朱秋華等[2]研究的仿生鱉與溫室鱉的營養(yǎng)成分比較的結(jié)論相一致，仿生鱉和溫室鱉肝臟組織中各營養(yǎng)成分含量差異顯著，裙邊和

37、肌肉組織中差異不顯著。仿生鱉肌肉中必需氨基酸和鮮味氨基酸含量均比溫室鱉高。</p><p>　　而注射了地塞米松磷酸鈉注射液的小鼠的吞噬百分率明顯比喂養(yǎng)甲魚的對照組低。這是因為地塞米松為腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，具有抗炎、抗免疫、抗毒素和抗休克作用。注射了這種免疫抑制劑的小鼠的免疫力下降，抵抗力減弱，腹腔巨噬細胞由于藥物的刺激而使細胞的吞噬能力下降。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響，能夠為甲魚的保健功效提供一定的事實依

38、據(jù)。</p><p>　　3.4 MDA含量的測定</p><p>　　MDA為丙二醛，自由基在機體內(nèi)作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，其反應(yīng)的終產(chǎn)物為丙二醛，它會交聯(lián)聚合蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)，并有細胞毒性。試驗?zāi)└鹘M小鼠處死后立即取肝組織檢測MDA活性。</p><p>　　結(jié)果如表7所示，各組MDA含量差異均不顯著（P≥0.05)；免疫抑制組與對照組肝組織MDA含量

39、變化不明顯，表明甲魚在一個月左右短時間試驗對小鼠肝組織MDA生成含量未造成影響。</p><p>　　MDA活性的高低間接反映機體內(nèi)組織細胞受自由基的攻擊程度的大小。甲魚肝組織MDA含量測定發(fā)現(xiàn)野生甲魚對照組均低于顆粒飼料對照組和溫室甲魚對照組。免疫抑制組、溫室甲魚免疫抑制組及野生甲魚抑制組比較結(jié)果測定，飼喂甲魚組肝組織MDA含量均低于飼喂顆粒飼料組。表明野生甲魚能夠一定程度減少肝組織中MDA含量，減少細胞受自由

40、基的攻擊，延緩機體衰老。</p><p>　　表7 小鼠肝組織MDA含量</p><p>　　3.5 小鼠碳廓清實驗的影響</p><p>　　單核巨噬細胞的吞噬機能是反映動物非特異性免疫功能的主要指標之一。在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系[11]。碳廓清實驗測定小鼠非特異性免疫功能的常用方法之一。由表8可見，無論是兩種性別還是單一性別小

41、鼠比較，組間均無顯著性差異。</p><p>　　飼喂方式一樣，比較打免疫抑制劑和用等量生理鹽水代替的小鼠之間的吞噬指數(shù)，對照組較免疫抑制組高，這說明抑制劑影響小鼠的吞噬能力，甲魚對小鼠的碳廓清速率有所提高。而比較野生甲魚對照組、溫室甲魚對照組及野生甲魚免疫抑制組、溫室甲魚抑制組，飼喂野生甲魚的小鼠的吞噬指數(shù)明顯比飼喂溫室甲魚的小鼠的吞噬指數(shù)高，這也進一步證實了野生甲魚的營養(yǎng)價值和保健功效比溫室甲魚高，與占秀安等

42、[12]的研究報道相一致。</p><p>　　表8 小鼠吞噬指數(shù)（a）比較</p><p><b>　　4 結(jié)論和展望</b></p><p>　　本實驗通過采用地塞米松磷酸鈉注射液，注射小鼠0.25mL/只構(gòu)建免疫抑制模型，飼喂野生甲魚、溫室甲魚和普通飼料后，檢測小鼠體重、脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、MDA含量、吞噬指數(shù)等生理生化指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實

43、驗小鼠在試驗期間生長發(fā)育未見異常，初、末體重各組間均不顯著；小鼠不同性別雌雄間臟器系數(shù)比較，各組間脾臟系數(shù)差異極顯著（P<0.01），而胸腺系數(shù)差異不顯著（P>0.05）；飼喂野生甲魚組的小鼠的肝組織MDA含量較飼喂顆粒飼料組的小鼠低，但差異不顯著（P>0.05），表明野生甲魚能夠減少肝組織MDA含量，減少細胞受自由基的攻擊，增強小鼠的抗氧化能力，一定程度上反應(yīng)了野生甲魚能夠延緩衰老；碳廓清實驗測定結(jié)果顯示，無論是兩種

44、性別還是單一性別小鼠比較，組間均無顯著性差異。</p><p>　　曾有學者報道發(fā)現(xiàn)甲魚主要功效有抗氧化，提高機體免疫，促進傷口愈合，滋陰，滋補，提高血漿蛋白蛋白含量，促進造血功能，增強體力，清熱等[13]。本實驗結(jié)果也在一定程度上證實了甲魚的營養(yǎng)價值和保健功效。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 陳瑞,

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