內(nèi)源性HMGB1對(duì)急性腸炎小鼠MDSCs免疫抑制功能的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、高遷移率簇蛋白1（High mobility group box-1 protein，HMGB1)是一種存在于幾乎所有真核生物細(xì)胞內(nèi)的保守的染色體結(jié)合蛋白，在胞內(nèi)，它能夠與 DNA直接相結(jié)合，或者與一些調(diào)節(jié)性的蛋白以及與DNA形成復(fù)合物，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB）與靶基因相結(jié)合，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄；HMGB1還可以通過(guò)主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放到細(xì)胞胞外，作為一種炎癥因子促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞（Myeloid-derive

2、d suppressor cells，MDSCs）是一群異質(zhì)性的未成熟的細(xì)胞群體，在腫瘤和炎癥等病理過(guò)程中起著重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。有研究報(bào)道，在急性或慢性炎癥過(guò)程中 MDSCs募集均增多，并且能發(fā)揮抑制炎癥的作用；采用外源性 HMGB1刺激 MDSCs能通過(guò)激活下游 NF-κB通路來(lái)增強(qiáng)其免疫抑制功能，但是，MDSCs胞內(nèi)自身表達(dá) HMGB1對(duì)其影響尚不清楚。故本課題擬采用 DSS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎模型，通過(guò) siRNA干擾腸炎小鼠

3、MDSCs內(nèi)源性 HMGB1的表達(dá)，從而研究胞內(nèi)HMGB1對(duì) MDSCs免疫抑制功能的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制，為臨床上腸炎等炎癥性疾病的治療提供新的理論依據(jù)和線索。
　　第一部分干擾HMGB1表達(dá)對(duì)MDSCs免疫抑制功能的影響及其分子機(jī)制研究
　　方法:
　　1.構(gòu)建 DSS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎模型，分離純化其脾臟中 MDSCs，運(yùn)用Western Blot和 ELISA技術(shù)檢測(cè)小鼠腸炎各時(shí)期 MDSCs的百分比、是否分

4、泌HMGB1，并利用其體外培養(yǎng)上清液刺激RAW264.7細(xì)胞，采用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其分泌的HMGB1是否具有促炎活性。
　　2.設(shè)計(jì)并合成 HMGB1的siRNA序列，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾 MDSCs內(nèi)源性HMGB1的表達(dá)。
　　3.運(yùn)用 CFSE增殖遞減法檢測(cè) MDSCs對(duì) T細(xì)胞增殖抑制功能的改變，運(yùn)用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)以及 RT-PCR等技術(shù)檢測(cè) MDSC功能相關(guān)分子 IL-10、TGF-β、iNOS、Arg-I和

5、ROS的表達(dá)以及NO的產(chǎn)生。
　　4.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組 MDSCs分化成熟的表面標(biāo)志 CD80，CD86和MHC-II類分子I-A/I-E的表達(dá)。
　　5.運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組MDSCs中NF-κB(p-p65及IκB-α)的表達(dá)；采用外源性HMGB1激活MDSCs中NF-κB的活性，從而驗(yàn)證MDSCs功能降低是否與NF-κB的失活有關(guān)。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠在飲含2.5％DSS水后

6、第8天急性腸炎癥狀（如糞便潛血、體重下降）明顯，而在第19天腸炎癥狀基本消失；急性腸炎期脾臟及腸系膜淋巴結(jié)的MDSCs比例逐漸增高，且恢復(fù)期MDSCs比例顯著高于急性期。
　　2.通過(guò) Percoll密度梯度離心法及免疫磁珠法分離、純化急性腸炎恢復(fù)期小鼠脾臟的MDSCs，其純度可達(dá)95%以上；此 MDSCs能夠分泌大量HMGB1，且后者能刺激RAW264.7細(xì)胞分泌促炎因子IL-1?和IL-6等。
　　3.轉(zhuǎn)染 HMGB1的

7、siRNA序列能夠在 mRNA及蛋白水平上干擾 MDSCs胞內(nèi)HMGB1表達(dá)。
　　4.瞬時(shí)干擾HMGB1表達(dá)后能降低MDSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用，主要通過(guò)降低MDSCs的iNOS和IL-10表達(dá)及NO產(chǎn)生，從而降低其免疫抑制功能。
　　5.瞬時(shí)干擾HMGB1表達(dá)后MDSCs表型趨于成熟，其表達(dá)CD80和MHC-II類分子I-A/I-E的水平顯著增高。
　　6.運(yùn)用 Western Blot技術(shù)檢測(cè) NF-κB的表

8、達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)干擾 HMGB1后MDSCs中 p65磷酸化水平以及 IκB-α降解顯著降低；給予外源性 HMGB1刺激能逆轉(zhuǎn)MDSCs的NF-κB活性，恢復(fù)MDSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制功能，增加其iNOS和IL-10表達(dá)及NO釋放。
　　上述結(jié)果表明：干擾 MDSCs內(nèi)源性HMGB1表達(dá)能顯著降低 MDSCs的NF-κB活性，從而降低MDSCs的免疫抑制功能，促進(jìn)其分化成熟。
　　第二部分干擾HMGB1表達(dá)能降低MDSCs

9、對(duì)小鼠急性腸炎的抑制作用
　　方法:
　　1.分別在給小鼠飲含2.5%DSS水的第2、4和6天，經(jīng)尾靜脈將干擾HMGB1表達(dá)后的MDSCs回輸至腸炎小鼠；
　　2.觀察飲含2.5%DSS水后第8天急性腸炎小鼠的體征、結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸組織的病理改變；
　　3.運(yùn)用 ELISA技術(shù)檢測(cè)急性腸炎小鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中的細(xì)胞因子 IL-1β、IFN-γ、IL-10及小分子NO等的變化。
　　結(jié)果:
　　1.相

10、對(duì)于MDSCs輸注對(duì)照組，過(guò)繼輸注瞬時(shí)干擾HMGB1的MDSCs組其小鼠急性結(jié)腸炎的體征以及結(jié)腸的病理?yè)p傷均明顯加重；
　　2.相對(duì)于MDSCs輸注對(duì)照組，過(guò)繼輸注瞬時(shí)干擾HMGB1的MDSCs組的急性結(jié)腸炎小鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中抑炎因子IL-10及NO表達(dá)水平顯著下降，而促炎因子IL-1β及IFN-γ表達(dá)水平顯著升高。
　　上述結(jié)果說(shuō)明：相對(duì)于 MDSCs輸注對(duì)照組，過(guò)繼輸注干擾 HMGB1表達(dá)的MDSCs對(duì)DSS誘導(dǎo)的