重組人HMGB1蛋白主動(dòng)免疫對(duì)小鼠乳腺癌影響的初步評(píng)估.pdf

1、背景：高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的高度保守的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，參與DNA修復(fù)、重組、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄等多種生命活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，被釋放到細(xì)胞外的HMGB1明顯增多。胞外HMGB1通過(guò)與靶細(xì)胞上的受體TLRs或RAGE結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，而HMGB1拮抗劑能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。我們據(jù)此推測(cè)，以HMGB1蛋白制備的疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫可能會(huì)影響宿主

2、腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。
　　目的：利用在原核系統(tǒng)表達(dá)、純化的重組人HMGB1蛋白作為免疫源并給予小鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫，繼而對(duì)免疫成功的小鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)情況做初步的評(píng)估。
　　方法：將本課題組成功構(gòu)建的含有人HMGB1基因的pET28a-HMGB1導(dǎo)入大腸桿菌BL21內(nèi)，以乳糖（1g/L）誘導(dǎo)HMGB1蛋白表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE及Western Blotting進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。進(jìn)一步通過(guò)鎳柱親和層析系統(tǒng)分離純化重組的HM

3、GB1蛋白。將純化的重組HMGB1蛋白與弗氏佐劑混合制備成疫苗，對(duì)BALB/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，對(duì)照組小鼠給予等量PBS注射。用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗HMGB1抗體效價(jià)。待抗體效價(jià)穩(wěn)定后，將4T1乳腺癌細(xì)胞接種于小鼠右腋皮下建立移植瘤模型。成瘤后，每隔兩天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤組織的最長(zhǎng)徑和最短徑計(jì)算相對(duì)腫瘤體積和相對(duì)腫瘤增殖率;采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平。根據(jù)HMGB1免疫組小

4、鼠和對(duì)照組小鼠的相對(duì)腫瘤體積、實(shí)體瘤重量、組織學(xué)觀察、抑瘤率等指標(biāo)來(lái)初步評(píng)估HMGB1主動(dòng)免疫對(duì)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果：SDS-PAGE及Western Blotting結(jié)果表明成功得到重組人HMGB1蛋白。以HMGB蛋白作為免疫源免疫雌性BALB/c小鼠后，小鼠血清中抗HMGB1抗體呈陽(yáng)性，且隨著免疫次數(shù)的增加，抗體滴度逐漸升高，經(jīng)過(guò)6次免疫后，小鼠體內(nèi)抗HMGB1抗體效價(jià)逐漸趨于穩(wěn)定，對(duì)照組小鼠血清中抗HMGB1抗

5、體為陰性。接種4T1乳腺癌細(xì)胞株后第六天，在HMGB1免疫組及對(duì)照組小鼠的接種部位可觸及不同程度大小的皮下瘤結(jié)節(jié)，成瘤率100％。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組小鼠荷瘤體積逐漸地增大，HMGB1免疫組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度快于對(duì)照組，實(shí)體瘤重量也高于對(duì)照組(2.337±0.3122g vs1.997±0.2401g)，抑瘤率為-17％。雙抗體夾心ELISA結(jié)果顯示，HMGB1免疫組小鼠荷瘤后，其血清中HMGB1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。
　　結(jié)