重組人HMGB1 A box的表達(dá)純化及對(duì)單核細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、一.立題目的和依據(jù)
　　 人高遷移率族B1(high mobility group box1,HMGB1)是含有215個(gè)氨基酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的高度保守的蛋白,因其相對(duì)分子質(zhì)量小(M＜30000),在聚丙烯酰胺凝膠電泳中快速遷移而被命名。HMGB1包括3個(gè)不同的功能區(qū),其N-端包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域:HMBG A box和HMBG B box,均由約80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,富含帶正電荷的賴氨酸呈較強(qiáng)的堿性,為DNA非特異結(jié)合區(qū)

2、;酸性C-末端包含超過30個(gè)連續(xù)的天冬氨酸和谷氨酸殘基,籍以完成與其它蛋白質(zhì)間相互作用及調(diào)節(jié)HMGB1與DNA結(jié)合[1]。HMGB1蛋白在胞內(nèi)外都有分布,根據(jù)其分布不同而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。人和小鼠的HMGB1只有兩個(gè)氨基酸的差異,HMGB1缺陷的小鼠在出生后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)死亡,說明HMGB1蛋白在維持細(xì)胞功能方面起著重要的作用[2-3]。細(xì)胞內(nèi)HMGB1參與構(gòu)建核小體,該蛋白和DNA的小溝結(jié)合后改變DNA雙螺旋構(gòu)型,增加轉(zhuǎn)錄因子和D

3、NA相互作用的親和力調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)在DNA重組、復(fù)制和修復(fù)中亦起重要的輔助作用。細(xì)胞外HMGB1具有細(xì)胞因子特性,它與細(xì)胞分化、遷移、增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)等密切相關(guān)[4-6]。盡管HMGB1蛋白缺少引導(dǎo)肽,且不能穿出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基細(xì)胞器,但仍可通過以下兩種途徑釋放,一是由壞死但未凋亡的細(xì)胞釋放,一是炎性因子刺激細(xì)胞后由細(xì)胞主動(dòng)分泌,這些細(xì)胞如:巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等[2]。研究表明,HMGB1與炎細(xì)胞表面的RAGE、TLR

4、-2、TLR-4等受體相互結(jié)合后可引發(fā)MAPK的磷酸化、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和活化蛋白-1的核內(nèi)轉(zhuǎn)移,使許多炎性因子如IL-1β、TNF-α、IL-8等表達(dá)加強(qiáng)和釋放增多而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)或使炎癥惡化[7]。當(dāng)細(xì)胞壞死或受損時(shí),在TNF的作用下核內(nèi)的HMGB1可釋放到胞外,引發(fā)單核巨噬細(xì)胞分泌促炎因子;而促炎因子又可進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的分泌,形成正反饋環(huán)[1]。在炎性反應(yīng)的后期,這種正反饋效應(yīng)對(duì)SLE等疾病炎性反應(yīng)的維持具有重要的作用。<

5、br>　　 在培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中分別加入HMGB1和B box蛋白,結(jié)果顯示經(jīng)二者刺激后均有較高水平的TNF-α的產(chǎn)生,使用抗B box蛋白的抗體后顯示二者的TNF-α的產(chǎn)生水平明顯降低,表明HMGB1的致炎作用主要是由其B box結(jié)構(gòu)域來行使,并且單獨(dú)B box即可發(fā)揮致炎作用。同樣在巨噬細(xì)胞中加入A box蛋白后可以明顯降低HMGB1刺激后TNF-α的產(chǎn)生水平。表明A box蛋白起到了抑制炎癥的作用成為HMGB1有效的拮抗劑[1、8

6、]引。為探討HMGB1 Abox在SLE等自身免疫病中的治療作用,我們進(jìn)行了其表達(dá)載體構(gòu)建、重組蛋白純化和生物學(xué)活性的研究。
　　 二.方法和結(jié)果：
　　 1.成熟人HMGB1 A box的基因克隆及序列分析
　　 根據(jù)GenBank報(bào)導(dǎo)的成熟人HMGB1編碼序列對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,調(diào)整密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index,CAI)使得CAI數(shù)值為0.95,增加編碼序列中GC含量延長mRNA的半

7、衰期,去除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),全基因合成質(zhì)粒DNA pUC57-HMGB1。根據(jù)優(yōu)化后的HMGB1基因序列我們?cè)O(shè)計(jì)合成了擴(kuò)增HMGB1 A box基因片段引物,分別在上下游引物5'端加上限制性酶切位點(diǎn)Nde I和Xho I,以優(yōu)化后的HMGB1基因序列為模板,用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增HMGB1 A box基因片段。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,膠回收試劑盒回收分離目的基因片段。將目的基因片段插入克隆載體pMD19-T,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH

8、5a,接種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板。菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽性克隆,采用.ABI3100-Avant GeneticAnalyzer全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序,結(jié)果顯示,克隆的基因序列和優(yōu)化后的成熟人HMGB1 A box基因序列完全一致。成功構(gòu)建了人HMGB1 A box的重組質(zhì)粒pMD19-T-HMGB1 A box。
　　 2.人HMGB1 A box的基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組蛋白的鑒定
　

9、　 用Nde I和Xho I雙酶切消化重組質(zhì)粒pMD19-T-HMGB1 A box,低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化HMGB1 A box基因片斷,插入原核表達(dá)載體pQE-T7-2的相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建重組pQE-A box表達(dá)載體。重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(EcoliDH5α),接種于含50μg/mL卡那霉素(Kanamycin)的LB平板,菌落PCR鑒定陽性重組。挑選陽性重組的單個(gè)菌落接種于含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,提

10、取質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)。挑選單個(gè)菌落接種于含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,按1:100的比例稀釋后接種于含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩至對(duì)數(shù)生長期,加入IPTG誘導(dǎo)4小時(shí),離心收集菌體行SDS-PAGE和Western blotting分析。
　　 SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后pQE-A box陽性重組菌株在相對(duì)分子量(Mr)約為14000處可見一明顯蛋白條帶,與預(yù)期蛋白大小

11、相符,圖像掃描儀分析顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40％左右。Western blotting顯示重組蛋白能與抗人HMGB1多克隆抗體和抗His-Tag多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),表明重組蛋白為特異性人HMGB1 A box蛋白。
　　 3.人HMGB1 A box蛋白的純化及生物活性測(cè)定
　　 收集菌體,冰浴中超聲裂解,離心收集上清。沉淀經(jīng)0.5％triton X-100洗滌即為粗提的包涵體。7M尿素溶解包涵體離心后收集上清

12、,超聲后上清及包涵體裂解產(chǎn)物行SDS-PAGE。結(jié)果顯示重組蛋白存在于上清中,提示HMGB1 A box以可溶性形式表達(dá)于菌株胞漿。經(jīng)Ni2+-NTA層析柱純化后SDS-PAGE檢測(cè)純化后的蛋白,結(jié)果顯示重組蛋白HMGB1 A box純度達(dá)90％以上。透析純化后的蛋白去除咪唑等小分子物質(zhì)。
　　 按文獻(xiàn)制備細(xì)胞壞死液[9].免疫復(fù)合物(IC)由細(xì)胞壞死液與SLE患者血清以25:1的比例配制。U937細(xì)胞(3×108/L)接種于1

13、2孔板,1 m1/孔。實(shí)驗(yàn)分LJ937細(xì)胞+IC組,U937細(xì)胞+IC+HMGB1 A box組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃50ml/LCO2條件下孵育24 h。收集細(xì)胞,提取總RNA,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞IFN-γ、BAFF及TNF-α水平,同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖像經(jīng)凝膠圖像掃描儀掃描并分析,采用相對(duì)指數(shù)(Relative index,PI)計(jì)算BAFF、IFN-γ及INF-α的表達(dá)水平。結(jié)果顯示HMGB1

14、 A box蛋白可有效抑制IC刺激單核細(xì)胞后BAFF、TNF-α及IFN-γ的分泌,提示所制備的人HMGB1 A box蛋白具有顯著的生物活性。
　　 三.結(jié)論：
　　 1.成功克隆了人HMGB1 A box基因,序列分析顯示,克隆的基因序列和優(yōu)化后的基因序列一致。
　　 2.構(gòu)建了人HMGB1 A box的原核表達(dá)載體,獲得穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株。
　　 3.初步摸索優(yōu)化了重組人pQE-A box的表達(dá)條件