人HMGB1 A box及B box cDNA的克隆、表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、感染、組織損傷、創(chuàng)傷時(shí)天然免疫系統(tǒng)被激活，誘發(fā)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，在臨床上極為常見(jiàn)。其發(fā)生的基本過(guò)程是：感染性(如細(xì)菌、病毒感染等)和非感染性(如創(chuàng)傷、缺氧、失血性休克等)因素導(dǎo)致機(jī)體的多種細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)被激活，釋放一系列致炎細(xì)胞因子(如TNF、IL-1、IL-6等)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，如果不能得到及時(shí)控制，便可發(fā)展為全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及膿毒癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致DIC、多器官功能衰竭乃至死亡。長(zhǎng)期以來(lái)，人

2、們一直致力于抑制致炎因子活性的研究，于是，針對(duì)TNF、IL-1等致炎因子的拮抗劑廣泛用于抗感染的研究，雖然有一定療效，但對(duì)于炎癥晚期所引起的SIRS及膿毒癥卻無(wú)能為力。其原因在于大多數(shù)致炎因子在發(fā)生炎癥反應(yīng)的6個(gè)小時(shí)內(nèi)即已經(jīng)釋放并達(dá)高峰(這些致炎因子被稱為早期炎癥因子)，故針對(duì)這些早期炎癥因子的臨床治療窗口期相當(dāng)窄，稍一延遲其治療效果就會(huì)大大降低，甚至根本無(wú)效。于是，研究者們致力于尋找晚期致炎因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1(h

3、ighmobilitygroupbox-1protein，HMGB1)，一種廣泛存在的、高度保守的細(xì)胞核非組蛋白，主要在核內(nèi)參與核蛋白復(fù)合體組成、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。當(dāng)其釋放至胞外時(shí)，可作為晚期致炎因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時(shí)HMGB1本身也能刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌TNF、IL-1、IL-6等致炎細(xì)胞因子。大量的報(bào)道證實(shí)，HMGB1與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，成為潛在的介導(dǎo)炎癥的中心[1-5]。人HMGB1全長(zhǎng)含215個(gè)氨基酸殘

4、基，其中有2個(gè)約80個(gè)氨基酸殘基組成的HMG“box”，分別是Abox(1-85氨基酸)和Bbox(88-162氨基酸)。經(jīng)結(jié)構(gòu)功能分析，HMGB1的致炎活性主要位于Bbox，而Abox卻對(duì)HMGB1全長(zhǎng)及Bbox誘導(dǎo)細(xì)胞分泌致炎因子有一定的拮抗作用[6]。因此，HMGB1有望成為抗炎治療時(shí)藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)[7,8]?；谝陨戏治觯覀冞M(jìn)行了人HMGB1Abox及BboxcDNA的克隆，重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及生物

5、學(xué)活性的初步鑒定，旨在為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)新型抗炎治療候選制劑，以及為深入闡明HMGB1的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 目的：克隆編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，將其構(gòu)建于原核表達(dá)載體后，利用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，最終獲得具有生物學(xué)活性的重組目的蛋白。 材料與方法：1.克隆編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA。自人扁桃體組織提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)GenBank中編碼人HMGB

6、1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物進(jìn)行RT-PCR，2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察并記錄結(jié)果。RT-PCR產(chǎn)物連接于pUC19質(zhì)粒，重組質(zhì)粒分別命名為pUC19/HMGB1Abox和pUC19/HMGB1Bbox，然后送上海生工公司和大連寶生物公司測(cè)序。 2.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。酶切pUC19/HMGB1Abox和pUC19/HMGB1Bbox質(zhì)粒，將回收的目的片段HMGB1Abox及HMGB1Bb

7、ox分別連接于含有表達(dá)運(yùn)載蛋白DHFR基因的原核表達(dá)載體pQE-80L/DHFR，經(jīng)酶切鑒定得到重組原核表達(dá)載體pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox和pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox。 3.目的蛋白的表達(dá)與鑒定。將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox、pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox及含HMGB1全長(zhǎng)基因的另一重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/HMGB1(本室構(gòu)建)，轉(zhuǎn)化大腸桿

8、菌DH5α，根據(jù)優(yōu)化確定的IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并行SDS-PAGE(5％積層膠，15％分離膠)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。再經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlotting)鑒定目的蛋白的表達(dá)。 4.目的蛋白的分離純化。收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌，鑒定目的蛋白的表達(dá)方式。將超聲碎菌離心后的上清過(guò)Ni2+-NTA柱純化目的蛋白，純化后的目的蛋白再過(guò)多粘菌素B柱以消除目的蛋白中的LPS對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。 5

9、.體外生物學(xué)活性的初步鑒定。ELISA檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞受目的蛋白刺激后所分泌的TNF-α、IL-6的水平。 結(jié)果：1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，片段長(zhǎng)為255bp和225bp。經(jīng)序列比對(duì)，與GenBank中報(bào)道的已知序列完全一致。 2.重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox和pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox經(jīng)雙酶切后，分別可見(jiàn)大小約為2

10、55bp和225bp的片段。酶切結(jié)果表明兩表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3.經(jīng)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化和篩選，確定了最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度1mmol/L的IPTG，在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。SDS-PAGE分析可見(jiàn)，表達(dá)的目的蛋白和DHFR融合蛋白的大小分別約為36kDa、35kDa、30kDa和26kDa。其中目的蛋白的表達(dá)量經(jīng)軟件分析，達(dá)到了細(xì)菌表達(dá)蛋白總量的約40％，主要是以分泌形式表達(dá)。經(jīng)WesternBlotting證實(shí)，在大小分別約

11、為36kDa、35kDa、30kDa和26kDa的位置有清楚的蛋白條帶。 4.目的蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，再經(jīng)多粘菌素B柱有效地去除了LPS，純化的蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，證明目的蛋白得到有效的純化。 5.生物學(xué)活性的初步分析顯示，所制備的目的蛋白HMGB1、HMGB1Bbox可有效地刺激人外周血單核細(xì)胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6；另一目的蛋白HMGB1Abox能有效地抑制HMGB1及HMGB

12、1Bbox誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6，而用于對(duì)照的DHFR融合蛋白沒(méi)有表現(xiàn)出任何生物學(xué)活性。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)，成功地自人扁桃體組織克隆了編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，并成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox和pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox。將上述質(zhì)粒及含HMGB1全長(zhǎng)基因的另一重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/HMGB1分