PTHrP-,1-34-對小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的:多種癌癥可以發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，如乳腺癌、肺癌、腎癌，腫瘤細胞、成骨細胞、破骨細胞和骨基質(zhì)細胞分泌的細胞因子相互作用共同促進了腫瘤骨轉(zhuǎn)移的形成和發(fā)展。腫瘤細胞釋放的某些因子促使骨轉(zhuǎn)移及骨破壞的形成，骨破壞后骨微環(huán)境中的多種細胞因子趨化腫瘤轉(zhuǎn)移至骨并促進腫瘤的生長，這一惡性循環(huán)中的多種因子甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP），轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），核因子кB受體活化因子（RANK）近來成為研究熱點。其中PTHrP在某些腫瘤組織中過度

2、表達，其作為主要的破骨細胞活性介導(dǎo)因子之一，誘導(dǎo)破骨細胞分化和成熟，在癌癥溶骨性骨轉(zhuǎn)移及骨破壞的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。以乳腺癌為例，多數(shù)研究表明PTHrP在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中具有非常重要的作用。但也有人提出PTHrP在乳腺癌原發(fā)灶中的表達可以改善預(yù)后，使癌細胞侵襲性降低，提高患者生存質(zhì)量。本研究主要目的是制備小鼠乳腺癌模型，人為持續(xù)給予大劑量PTHrP1-34，結(jié)合全身X線、疑有病變骨組織的病理切片、離體骨生物力學(xué)試驗、股骨灰干重比等

3、指標(biāo)，并測定骨轉(zhuǎn)換血清生化標(biāo)志物，同時對瘤體進行觀察與測量，研究持續(xù)性大劑量PTHrP1-34對小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移及骨代謝的影響，為明確開發(fā)抗-PTHrP抗體來抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移是否有意義奠定基礎(chǔ)。 方法:預(yù)實驗中分別采用腫瘤細胞懸濁液注射法和腫瘤組織塊懸濁液注射法制備小鼠乳腺癌模型，且兩組各隨機選取1只，剝離腫瘤塊做病理切片證實為乳腺癌，以選取較好的荷瘤鼠造模方法，結(jié)果得出后者為佳。40只4-6周齡BALB/C小鼠，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)

4、1周，按體重編號，采用隨機數(shù)字法將其隨機分為三組，1組12只作為正常對照組（對照組），2、3組各14只，前肢腋下皮下注射乳腺癌組織塊懸濁液制備小鼠乳腺癌模型，10天后以腫瘤長徑大于4mm做為造模成功鼠，最后入選的小鼠每組各12只。成模后，2組每日予以生理鹽水腹腔注射（模型組），3組每日予以PTHrP1-34400μg/kg腹腔注射（實驗組）。實驗期間，每周固定時間測小鼠體重，觀察腫瘤生長情況，持續(xù)40d后摘眼球取血處死，測定血清中反映骨

5、轉(zhuǎn)換的生化指標(biāo)水平，包括鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（BGP）、Ⅰ型膠原C-末端交聯(lián)頂端肽β（β-CTX）、骨唾液酸蛋白（BSP），處死前行全身骨X線掃描，觀察骨破壞情況，定位疑有病變部位，測全身BMD（DEXA法），剝離腫瘤測其大小與重量，留取腰椎、股骨、脛骨等標(biāo)本，用萬能材料分析儀行腰椎（L5）壓縮試驗及股骨三點彎曲試驗并行骨礦含量測定，疑有病變的脛骨制備脫鈣骨石蠟切片、HE染色，進行病理學(xué)觀察。所有數(shù)據(jù)均以均

6、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量樣本均數(shù)組間的比較用獨立樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用四格表資料確切概率法，P<0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、荷瘤小鼠成模情況：預(yù)試驗中分別采用腫瘤細胞懸濁液注射法和腫瘤組織塊懸濁液注射法制備小鼠乳腺癌模型，前者造模成功率87．5％，且成瘤時間不一，大小不均；后者可以形成成瘤時間、大小一致的荷瘤鼠，且成瘤率100％，本實驗中

7、采取腫瘤組織塊懸濁液注射法造模。 2、骨X線、局部解剖學(xué)及脫鈣骨石蠟切片觀察：模型組與對照組相比較，除1只外其余均未見明顯骨破壞現(xiàn)象，而實驗組有6只存有明顯的溶骨性骨破壞現(xiàn)象，以脛骨近端為明顯，其中1只左后肢脛骨骨折。率的比較用四格表資料確切概率法得出兩組荷瘤小鼠骨破壞發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．01）。取骨病理切片顯示為轉(zhuǎn)移瘤。 3、BMD與股骨灰干重比的比較：對照組、模型組與實驗組BMD、股骨灰干重比分別為62．

8、43±2．22（g/c㎡）、0．590±0．286，61．88±2．02（g/c㎡）、0．579±0．195，54．83±1．93（g/c㎡）、0．552±0．270，與對照組和模型組相比，實驗組BMD及股骨灰干重比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．01），與對照組相比，模型組BMD及股骨灰干重比有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。 4、骨生物力學(xué)特性：與對照組相比，實驗組小鼠股骨最大載荷降低了12．37％、彈性載荷

9、降低了11．72％、截面慣性矩降低了19．4％、彈性模量降低了26．16％、腰椎最大載荷降低了34．71％；與模型組比較，實驗組小鼠股骨最大載荷降低了13．12％、彈性載荷降低了15．61％、截面慣性矩降低了17．24％、彈性模量降低了15．47％、腰椎最大載荷降低了32％。與對照組和模型組比較，實驗組各指標(biāo)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．05或P<0．01），對照組與模型組間無顯著性差異。 5、血清中Ca、P、ALP、β-C

10、TX、BSP、BGP等骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)記物水平：三組小鼠間血清Ca水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比實驗組P、BSP、β-CTX等反映骨吸收的指標(biāo)分別升高了31．5％、31．58％、81．25％，血清總ALP、BGP等反映骨形成的指標(biāo)分別降低了19．57％、17．43％；與模型組相比，實驗組P、BSP、β-CTX分別升高了21．92％、14．93％、58．82％，ALP、BGP分別降低了12．48％、11．54％，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<

11、0．05或P<0．01）。與對照組相比，模型組血清P、BSP（P=0．064）有升高趨勢，ALP、BGP有降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。 6、荷瘤小鼠腫瘤大小及重量比較：模型組腫瘤質(zhì)量0．859±0．176（g），體積297．07±106．70（cm3），實驗組腫瘤質(zhì)量1．123±0．192（g），體積824．18±189．79（cm3）。與模型組比較，實驗組腫瘤生長快、質(zhì)量、體積大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．

12、01）。 7、三組小鼠體重的變化：與對照組比較，模型組和實驗組小鼠體重增長明顯緩慢，實驗結(jié)束時對照組、模型組與實驗組體重增長總量分別為6．15±1．00（g）、4．64±1．31（g）、3．73±0．87（g），后兩者均顯著低于對照組（P<0．01），而模型組與實驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。 結(jié)論: 1、小鼠乳腺癌細胞MA-782可以在BALB/c小鼠身上成功建立乳腺癌模型，其中腫瘤組織塊懸濁液法可

13、以形成成瘤時間、大小一致的荷瘤鼠，是研究人類乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等各種機制較理想的動物模型。 2、Ca、P、ALP、β-CTX、BSP、BGP等血清生化指標(biāo)、骨生物力學(xué)、全身骨X線掃描，都可以用于輔助判斷腫瘤骨轉(zhuǎn)移及溶骨性骨破壞，其中對乳腺癌患者的研究表明，血清BSP增加可以提示早期骨轉(zhuǎn)移，骨組織病理切片可以確診腫瘤骨轉(zhuǎn)移。由于小鼠BMD較小，其比較意義并不大。 3、荷瘤小鼠在PTHrP1-34作用下形成骨轉(zhuǎn)移性后，可

14、能是骨破壞后釋放的一系列細胞因子通過某種機制促進了腫瘤的生長，使得實驗組腫瘤體積與質(zhì)量較大，同時PTHrP可能具有直接促進腫瘤生長的作用。另外，荷瘤小鼠的病理狀態(tài)影響了其生長發(fā)育，使得體重增長緩慢。 4、長期給與大劑量PTHrP1-34后，荷瘤小鼠血清P、BSP、β-CTX等反映破骨細胞活性和骨吸收狀態(tài)的指標(biāo)升高，ALP、BGP等反映成骨狀況的指標(biāo)降低，且骨礦含量、骨生物力學(xué)特性、骨強度均降低，BSP的顯著升高以及病理切片證實了