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文檔簡介
1、近年來,乳腺癌已成為世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率及死亡率最高的癌癥,嚴(yán)重的影響了女性的健康和生活。大多數(shù)由乳腺癌引發(fā)的死亡是由轉(zhuǎn)移造成的。最近研究發(fā)現(xiàn),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的異常激活與乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移聯(lián)系密切。然而,在這個(gè)過程中,涉及轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制尚不明確。細(xì)胞命運(yùn)決定因子DACH1(dachshund homolog1)是果蠅dachshund基因的同源物,在人類乳腺癌
2、、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和肺癌等癌癥的成瘤過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。雖然發(fā)現(xiàn)DACH1能夠抑制癌基因誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,但是DACH1抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移和EMT的分子機(jī)制在很大程度上仍是未知的。因此,本研究從DACH1的表達(dá)水平和EMT的相關(guān)性入手,探討了DACH1抑制鋅指蛋白SNAI1(zinc finger protein SNAI1)介導(dǎo)的EMT及乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)理。本論文的主要工作如下:
1.在本研究中,以
3、人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D和ZR-75-30細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,通過相差顯微鏡成像,發(fā)現(xiàn)DACH1的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)顯著相關(guān)。通過細(xì)胞克隆分散、細(xì)胞劃痕和侵襲小室實(shí)驗(yàn)、免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明,在ZR-75-30細(xì)胞中,過表達(dá)DACH1誘導(dǎo)細(xì)胞向上皮形態(tài)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞間的粘連、上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin和Cytokeratin18、下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin、并且抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移
4、;相反,在MCF-7和T47D細(xì)胞中,干涉DACH1誘導(dǎo)細(xì)胞向間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)化、破壞細(xì)胞間的粘連、下調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin和Cytokeratin18、上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin、并且促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移。因此,確定DACH1是EMT的負(fù)調(diào)控因子。
2.通過RT-PCR和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),DACH1能促進(jìn)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而上調(diào)E-cadherin的mRNA水平。通過染色質(zhì)
5、免疫共沉淀和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明,DACH1以E-box依賴的方式激活E-cadherin的轉(zhuǎn)錄,并特異性的結(jié)合在E-cadherin的啟動(dòng)子上。DACH1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)對DACH1介導(dǎo)的E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性無影響,暗示存在其他因子介導(dǎo)DACH1與E-box的結(jié)合。
3.通過免疫共沉淀、哺乳動(dòng)物雙雜交和GST-pulldown實(shí)驗(yàn)證明,DACH1特異性的與SNAI1結(jié)合,而不與SNAI2結(jié)合。通過免疫
6、熒光實(shí)驗(yàn)證明,DACH1能與SNAI1在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生共定位。
4.通過連續(xù)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明,DACH1能與SNAI1形成復(fù)合物被招募到E-cadherin的啟動(dòng)子上。通過染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫印跡和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明,DACH1以SNAI1依賴的方式抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)。另外通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DACH1能夠抑制HDAC1與SNAI1的相互作用,表明DACH1與SNAI1的結(jié)合
7、抑制了SNAI1招募HDAC1,有效地抑制了SNAI1的活性,最終激活E-cadherin的表達(dá)。
5.此外,在小鼠肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)中,DACH1的水平也與轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。DACH1顯著的抑制了BALB/c小鼠體內(nèi)4T1/Luc細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。通過免疫組織化學(xué)方法分析人類乳腺癌組織發(fā)現(xiàn),DACH1與E-cadherin在SNAI1陽性的乳腺癌中顯著相關(guān)。
綜上所述,本論文揭示一種新的調(diào)控EMT及乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,即DAC
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