N-乙酰半胱氨酸對哮喘小鼠肺部HMGB1、RAGE表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景： 所有多細(xì)胞有機(jī)體的生存都依賴于氧氣的正常運輸和利用，在產(chǎn)生能量與生成潛在有毒氧化性物質(zhì)之間保持平衡。高氧(hyperoxia)或缺氧(hypoxia)時會產(chǎn)生大量活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，若機(jī)體抗氧化系統(tǒng)(包括內(nèi)源性抗氧化酶、攝入的天然抗氧化劑等)未能清除ROS，則發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidativestress)。氧化應(yīng)激參與眾多中毒性、感染性、炎癥性、神經(jīng)變性性及腫瘤性疾病[1]。

2、 氣道作為機(jī)體與外界相通的最大系統(tǒng)，需要很好的調(diào)控局部炎癥反應(yīng)以清除外來有害物質(zhì)，應(yīng)對氧化應(yīng)激并避免激活不必要的全身免疫反應(yīng)。哮喘是一種慢性氣道炎癥疾病，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用所導(dǎo)致的免疫失調(diào)[2]。哮喘存在氣道上皮細(xì)胞對氧化損傷易感性[3]，以及氧化.抗氧化失衡[4]。哮喘慢性炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激互為因果、相互促進(jìn)，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞凋亡、脫落及氣道重塑。一方面，飲食因素在此過程中具有重要地位，攝入天然抗氧化劑不足使得氣道抗

3、氧化能力降低，可能進(jìn)一步加重了哮喘進(jìn)展[5]。新的整合醫(yī)學(xué)觀念認(rèn)為，飲食調(diào)節(jié)作為補(bǔ)充替代治療措施，在治療哮喘中具有重要地位[6]。但盡管vitC/vitE被證明具有抗氧化功能，但既往多個臨床隨機(jī)對照研究并未在哮喘患者身上取得明顯療效[7]。而新近研究發(fā)現(xiàn)，一些富含特定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(maillardreactionproducts，MRPs)(如類黑精(melanoidins)、特定晚期糖基化終產(chǎn)物(Advancedglycatione

4、nd-products，AGEs))的食物顯示了安全有效的抗氧化功能[8]。另一方面，以N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)為代表的抗氧化治療已進(jìn)入臨床，但其應(yīng)用十分有限[9]。深入了解NAC作用機(jī)制及尋找其他有效抗氧化劑是十分有應(yīng)用前景的研究課題。 我們前期應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了哮喘發(fā)作與緩解外周血嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)cDNA文庫，初步篩選出56個差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)高遷

5、移率族蛋白B1(highmobilitygroupproteinB1，HMGB1)基因表達(dá)升高[10]。細(xì)胞核內(nèi)HMGB1具有穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄作用[11]，分泌至細(xì)胞外的HMGB1被認(rèn)為是重要的細(xì)胞因子，發(fā)揮前炎癥介質(zhì)及促進(jìn)組織修復(fù)因子的作用[12]，能啟動并調(diào)節(jié)固有免疫及獲得性免疫反應(yīng)[13]。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞釋放HMGB1至細(xì)胞外[14]，新近研究更表明氧化應(yīng)激可直接介導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)HMGB1空間變構(gòu)[15]。被氧化的HM

6、GBl是谷胱甘肽(glutathione，GSH)還原系統(tǒng)的作用底物[15]，提示了NAC作為GSH的前體物質(zhì)，與HMGB1之聞的可能關(guān)系。HMGB1的主要受體之一晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptorforadvancedglycationend-products，RAGE)，是肺泡上皮細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志[16]。以上資料提示，HMGB1、RAGE與肺部氧化應(yīng)激相關(guān)性疾病(如哮喘)的關(guān)系十分密切，但目前尚未有哮喘與HMGB1、RAGE關(guān)

7、系及NAC對此影響的文獻(xiàn)報道。 目的： 在哮喘BALB/c鼠模型，研究NAC等抗氧化劑對HMGB1及其受體RAGE表達(dá)的影響，以幫助理解氧化應(yīng)激在哮喘的作用及抗氧化治療的機(jī)制。 方法： 1.12只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、類黑精組、木糖-賴氨酸組，每組4只。類黑精組按文獻(xiàn)制備富含類黑精的面包皮并按比例加入小鼠飼料中；木糖.賴氨酸組按文獻(xiàn)制備MRPs溶液給小鼠灌胃。以正常飼料為對照，分別喂養(yǎng)15天

8、。用RT-PCR法觀察肺部HMGB1、RAGEmRNA水平變化。 2.(1).8只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、NAC組，每組4只。NAC組用NAC給小鼠灌胃。以正常飼料為對照，分別喂養(yǎng)15天。用RT-PCR法觀察肺部HMGB1、RAGEmRNA水平變化。 (2).15只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為設(shè)立對照組、哮喘組、哮喘+NAC組，每組5只。制備OVA致小鼠哮喘模型，1d、7d致敏，14～28天隔日一次激發(fā)。以鹽

9、水代替OVA作為對照組。NAC組在激發(fā)前一周開始每天給予NAC灌胃，灌胃1h后再行激發(fā)。觀察肺部HMGB1、RAGEmRNA水平變化。用免疫組織化學(xué)法觀察肺部炎癥情況，觀察肺組織切片HMGB1、RAGE分布及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.對照組、類黑精組、木糖-賴氨酸組HMGB1mRNA表達(dá)分別為0.81±0.10、0.88±0.08、0.87±0.05，各組之間比較F=0.789，P=0.483；RAGEmRNA表達(dá)分別

10、為1.48±0.13、1.65±0.23、1.51±0.12，各組之間比較F=1.163，P=0.356。可見與對照組相比，以面包皮喂養(yǎng)或MRPs灌胃，小鼠肺部HMGB1、RAGEmRNA并未發(fā)生顯著性變化(P>0.05)。 2. (1).HMGB1mRNA表達(dá)在對照組、NAC組中分別為7.49±2.28、11.01±5.51，方差齊性(F=1.800，P=0.228)，t=-1.181，P=0.282。RAGEmRNA

11、表達(dá)在對照組、NAC組中分別為6.46±0.98、7.51±1.56，方差齊性(F=0.224，P=0.653)，t=-1.143，P=0.296?？梢娕c對照組相比，NAC灌胃組小鼠肺部HMGB1、RAGEmRNA似有輕微升高，但并無顯著性差異(P>0.05)。 (2).HMGB1mRNA表達(dá)在對照組、哮喘組、哮喘+NAC組中分別為0.85±0.04，0.87±0.02，0.98±0.04，各組之間比較F=16.668，P=0.

12、000；RAGEmRNA表達(dá)在三組中分別為1.21±0.08，1.20±0.20，1.58±0.21，各組之間比較F=7.793，P=0.007。相對于對照組，哮喘組的HMGB1和RAGE表達(dá)未發(fā)生顯著性改變(HMGB1:P=0.484>0.05;RAGE:P=0.893>0.05)；相對于對照組和哮喘組，HMGB1、RAGE在哮喘+NAC組表達(dá)均顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(HMGB1:P=0.000<0.05；RAGE:P=0.001<

13、0.05)。 (3).免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與哮喘組相比，哮喘+NAC組HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)升高，肺部炎癥反應(yīng)減輕；HMGB1主要分布于支氣管及肺泡上皮細(xì)胞，在細(xì)胞核、胞漿及胞膜均可見，RAGE主要分布于肺泡上皮，表達(dá)于胞膜上。 結(jié)論： 1.食物來源的抗氧化性物質(zhì)類黑精、賴氨酸-木糖型AGEs可能對健康小鼠肺部HMGBl、RAGE不具有調(diào)節(jié)作用。但未在哮喘小鼠研究其作用。 2.抗氧化劑NAC對健康小鼠