血型B抗原模擬多肽-Fas重組腺病毒對小鼠4T1乳腺癌影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 機體的免疫系統(tǒng)具有控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的能力，是腫瘤研究中最古老的概念之一。其中腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)在腫瘤發(fā)生學及治療方面又具有至關重要的作用。隨著科學技術和方法學的進步，越來越多的腫瘤抗原被鑒定出來。研究者發(fā)現(xiàn)，雖然很多腫瘤抗原的免疫原性不弱，而且抗原提呈細胞可迅速呈遞大多數(shù)腫瘤抗原，腫瘤患者體內(nèi)也確實存在針對腫瘤抗原所產(chǎn)生的免疫應答，但相關免疫應答產(chǎn)物并不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應。當前多數(shù)免疫治療方法均能夠增強患

2、者全身的免疫功能，但抗瘤效果卻與預期的相差很多。原因主要在于腫瘤患者免疫功能狀態(tài)并不能直接反應機體的抗腫瘤免疫效應，即使患者全身免疫功能得到改善，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫效應卻仍處于抑制狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細胞本身、間質細胞、微血管、組織液及少量浸潤細胞，如樹突狀細胞、巨噬細胞等共同組成。作為腫瘤免疫效應階段的執(zhí)行場所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在多種因素均與局部免疫抑制狀態(tài)的產(chǎn)生有關，并形成了腫瘤局部微環(huán)境中特有

3、免疫模式。腫瘤細胞不僅逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，同時也抑制其生長環(huán)境中的免疫細胞的正常功能。這些因素為開辟新的腫瘤免疫治療方案提供了思路。
　　 隨著分子生物醫(yī)學的發(fā)展，免疫治療作為腫瘤第四種治療模式-生物治療的重要組成部分，在腫瘤治療中的地位和作用日趨重要。逆轉腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)是當前腫瘤免疫治療的難題與突破點。
　　 研究目的：
　　 應用健康成人B型血全血腹腔注射免疫BALB/c小鼠使其體內(nèi)產(chǎn)生抗血型抗原B

4、抗體;構建BALB/c小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型;在BALB/c小鼠荷瘤模型中瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒，測定其在腫瘤組織中的表達情況，觀察其對人紅細胞懸液免疫后的小鼠腫瘤生長的抑制作用及對生存期的影響;測定瘤內(nèi)注射重組病毒后小鼠腫瘤微環(huán)境淋巴細胞、TNF-α、IFN-γ、IL-2、微血管密度等免疫功能指標，判定其對腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的逆轉作用。
　　 實驗方法：
　　 1、將健康成人全血稀釋成不同濃

5、度紅細胞懸液，腹腔注射免疫BALB/c小鼠，每次0.2ml，2次/周，免疫后3天、7天、14天、21天、28天，分別測定小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗血型抗原B抗體效價，擇優(yōu)選擇最適宜的紅細胞懸液免疫濃度，分析抗體產(chǎn)生的趨勢，為后續(xù)試驗做準備;
　　 2、無菌環(huán)境下培養(yǎng)4T1乳腺癌細胞，至對數(shù)生長期，制備細胞懸液(濃度為106/ml)，小鼠乳腺脂肪墊區(qū)皮下注射上述濃度4T1乳腺癌細胞0.2ml。7天左右，腫瘤長至1cm左右大小，選取腫瘤無出血壞

6、死的小鼠進一步實驗;
　　 3、選取腫瘤大小相近、腫瘤無出血壞死的18只荷瘤小鼠，隨機分3組，分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad-P(1)/Fas(效價為7×1010pfu/mL)、空腺病毒(效價為2.21×1011pfu/mL)、0.9％NaCL0.1ml，連續(xù)注射3天。注射后第10天處死三組小鼠，取出腫瘤組織，應用westernblot方法測定B/Fas在腫瘤組織中的表達情況。流式細胞儀檢查腫瘤內(nèi)淋巴細胞的變化、ELISA法測定TN

7、F-α、IFN-γ、IL-2含量、免疫組織化學法檢測CD34表達，并判定其對腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的逆轉作用;
　　 4、36只荷瘤小鼠，分三組，每組12只，每組隨機取5只小鼠應用游標卡尺測量三組小鼠腫瘤長徑a和垂直寬徑b，比較注射前、注射后3天、7天、14天三組小鼠腫瘤體積變化，并觀察所有荷瘤小鼠的生存期，設定觀察期限為60天。腫瘤體積計算方法如下:V(cm3)=1/2a×b2。觀察不同處理對小鼠腫瘤生長的抑制作用及對生存期的

8、影響。
　　 5、統(tǒng)計方法
　　 (1)計量資料結果以均數(shù)±標準差表示;
　　 (2)不同分組不同時間抗血型抗原B抗體效價、目的蛋白B/Fas的表達量灰度值、腫瘤體積比較應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較，不同時間點各處理組間抗血型抗原B抗體效價、目的蛋白B/Fas的表達量灰度值、腫瘤體積、腫瘤內(nèi)淋巴細胞亞群、細胞因子的測定、腫瘤內(nèi)微血管密度比較應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包采用one-

9、wayANOVA方法分析及組間比較采用LSD法，如方差不齊則選擇近似F檢驗Welch法，及Dunnett'sT3組間比較。以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 (3)各組小鼠生存期間應用Kaplan-Meier法進行統(tǒng)計學檢驗。組間比較采用Logrank法。以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 實驗結果：
　　 1、成功應用健康成人B型紅細胞懸液誘導小鼠產(chǎn)生抗血型B抗原抗體，不同濃度紅細胞懸液之間的免疫作用無統(tǒng)計

10、學差異(F=1.871，P=0.196)，免疫后14天、21天抗體效價值達最高。
　　 2、瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒后3天、注射后7天、注射后10天、注射后14天，目的蛋白B/Fas均可在腫瘤組織中穩(wěn)定表達，且不同時間點表達量有顯著差異(F=36.322，P＜0.001)，以瘤內(nèi)注射后7-10天左右表達量最高。
　　 3、分別應用瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水處理經(jīng)紅細胞懸液免疫的小鼠，不同組間腫瘤

11、體積變化比較具有顯著差異(F=18.16，P＜0.001)。注射前、注射后3天、7天、14天不同時間點小鼠腫瘤體積變化比較具有顯著差異(F=129.291，P＜0.001)。
　　 4、瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水后三組荷瘤小鼠的生存期無顯著性差異(P=0.154)。
　　 5、小鼠腫瘤組織病理切片示人紅細胞懸液免疫后瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒10天后可使腫瘤細胞壞死及炎癥細胞的浸潤

12、明顯增加，對照組效果欠佳。
　　 6、瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒、瘤內(nèi)注射空腺病毒、瘤內(nèi)注射生理鹽水處理后10天，小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+淋巴細胞、CD4+淋巴細胞、CD8+淋巴細胞、CD4+CD25+淋巴細胞的比例在不同組間的比較有顯著性差異(F=104.835,P＜0.001;F=150.153,P＜0.001;F=48.494,P＜0.001;F=65.823,P＜0.001)。瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/

13、Fas重組腺病毒可明顯增加小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+淋巴細胞、CD4+淋巴細胞、CD8+淋巴細胞亞群的比例，并減少CD4+CD25+淋巴細胞的比例。
　　 7、瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水不同處理后10天，不同組間腫瘤內(nèi)TNF-α、IFN-γ、IL-2變化的比較均有統(tǒng)計學意義(F=16.418,P＜0.001;F=94.032,P＜0.001;F=69.848,P＜0.001)。不同組間多重比較示

14、，瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒可較對照組明顯增加腫瘤組織內(nèi)TNF-α、IFN-γ、IL-2含量，增強局部抗腫瘤效應。
　　 8、瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水不同處理后10天，瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒與瘤內(nèi)注射空腺病毒或生理鹽水組間微血管數(shù)量的比較均有顯著性差異(P=0.001，P=0.003)，而瘤內(nèi)注射空腺病毒與瘤內(nèi)注射生理鹽水組比較則差異無統(tǒng)計學意義(P=0.724)。瘤內(nèi)注射重組腺病

15、毒較對照組可明顯減少腫瘤內(nèi)微血管的數(shù)量。
　　 結論：
　　 重組腺病毒載體感染后，B/Fas融合蛋白在小鼠腫瘤組織中高效表達;經(jīng)健康成人B型血紅細胞懸液腹腔注射免疫后小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生有效的抗血型B抗原抗體;紅細胞懸液免疫后的BALB/c小鼠經(jīng)瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒處理可明顯抑制4T1乳腺癌的生長，與其他組的生存期比較無區(qū)別。與對照組比較，瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒可明顯增加腫瘤組織內(nèi)效應淋巴細胞的