新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP對(duì)小鼠4T1乳腺癌模型的治療作用.pdf

1、背景：
　　乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率已上升至女性惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。隨著現(xiàn)代手術(shù)技術(shù)的提高以及化療、放療等輔助治療手段的應(yīng)用，乳腺癌患者的總體生存率得到了改善，但是每年仍有30％-40％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者死亡。因此，在臨床研究中迫切需要尋找一種有效的乳腺癌治療手段。腫瘤靶向性溶腫瘤病毒(Tumour-targeted oncolytic virus，TOVS)是目前惡性腫瘤研究的新

2、熱點(diǎn)，其原理在于溶瘤病毒可以特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，進(jìn)而溶解腫瘤細(xì)胞，而這種溶瘤作用對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。研究發(fā)現(xiàn)TOV可通過(guò)多重作用機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效果，包括直接溶解細(xì)胞、表達(dá)毒性蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、深入誘導(dǎo)抗腫瘤免疫以及關(guān)閉宿主蛋白合成等，正是病毒治療機(jī)制的多樣性，國(guó)際上越來(lái)越多的研究者開始把目光轉(zhuǎn)移到溶瘤病毒治療方面來(lái)。最近研究發(fā)現(xiàn)痘苗病毒N1L蛋白是引起神經(jīng)毒性的重要因素，同時(shí)該基因產(chǎn)物可通過(guò)與IKK復(fù)合物的靶向結(jié)合來(lái)抑制NF-k

3、B和IRF3活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而拮抗宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此，N1L的刪除不僅可增加TOV安全性，更重要的是增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，有可能增強(qiáng)其抗腫瘤效果。我們實(shí)驗(yàn)室在VV△TK(在野生型Lister痘苗病毒的基礎(chǔ)上敲除Tymidine Kinase(TK)基因的病毒株）的基礎(chǔ)上敲除N1L基因來(lái)降低病毒毒性，同時(shí)并期望能夠激起機(jī)體更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。本研究通過(guò)體外、體內(nèi)對(duì)比研究該病毒對(duì)小鼠4T1乳腺癌的治療效果和生物安全性。

4、　　目的：
　　探討新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP及VV△TK對(duì)小鼠4T1乳腺癌的治療作用。
　　方法：
　　第一部分:溶瘤病毒的制備及鑒定，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測(cè)溶瘤痘苗病毒TK及N1L基因的刪除;
　　第二部分:體外，檢測(cè)溶瘤病毒對(duì)4T1細(xì)胞毒性，即采用MTS(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2

5、-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium）法檢測(cè)新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對(duì)照痘苗病毒VV△TK對(duì)BALB/c小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1的殺傷作用，計(jì)算其EC50值（即殺死50％細(xì)胞所需要的病毒量）;采用TCID50(Tissue culture infective dose 50％)法檢測(cè)新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對(duì)照痘苗病毒VV△TK在乳腺癌細(xì)胞株4T1中的

6、復(fù)制能力;
　　第三部分:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)建立小鼠4T1乳腺原位及轉(zhuǎn)移模型，檢測(cè)新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對(duì)照痘苗病毒VV△TK對(duì)其治療效果。
　　結(jié)果：
　　第一部分:病毒制備成功，并且最高滴度可達(dá)1011pfu/ml，病毒經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)證實(shí)，溶瘤痘苗病毒VV△TK基因序列中TK基因被刪除，新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP基因序列中TK及N1L基因被刪除。
　　第二

7、部分:在體外研究中，新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP的EC50平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（1.90±0.1）pfu/cell，對(duì)照痘苗病毒VV△TK的EC50平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為(7.18±2.2)pfu/cell，說(shuō)明VV△TK△N1L-RFP對(duì)4T1細(xì)胞的殺傷作用比VV△TK明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP感染4T1乳腺癌細(xì)胞后，不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)的病毒復(fù)制量分別

8、為:30.89pfu/cell、43.04pfu/cell、43.95pfu/cell，對(duì)照病毒VV△TK感染4T1乳腺癌細(xì)胞后，不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)的病毒復(fù)制量分別為:36.87pfu/eell、52.19pfu/cell、60.91pfu/cell，說(shuō)明兩種腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒均能在4T1細(xì)胞中復(fù)制，但兩者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　第三部分:在體內(nèi)研究方面，分別成功建立了小鼠4T1乳腺癌原位

9、模型、小鼠4T1乳腺癌自發(fā)轉(zhuǎn)移模型和小鼠4T1乳腺癌術(shù)后自發(fā)轉(zhuǎn)移模型。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):手術(shù)前瘤內(nèi)分別注射新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP、對(duì)照痘苗病毒VV△TK和空白對(duì)照PBS，小鼠4T1乳腺腫瘤體積的縮小雖然沒(méi)有明顯差別，但是經(jīng)過(guò)新型溶腫瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP治療過(guò)的小鼠手術(shù)后生存時(shí)間得到了明顯延長(zhǎng)。
　　結(jié)論：
　　新型腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和對(duì)照痘苗病毒VV