雙基因治療聯(lián)合放射治療小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抑瘤作用

1、1,IFN-γ和 ENDOSTATIN 雙基因治療聯(lián)合放射治療小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抑瘤作用,作者姓名（排序）：劉林林，張奇，張偉靜，T Conere, M Hurley作者單位：吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤生物治療科第一作者姓名及身份證號碼：劉林林220104197010270084通訊作者姓名：劉林林,一、研究背景,乳腺癌是西方女性中最常見的惡性腫瘤，這些病人中有30-50% 將會發(fā)生轉(zhuǎn)移。外科手術(shù)、放射治療和化療是治療乳腺癌患者最常用

2、的方法。然而這些常規(guī)治療方式并沒有提高局部晚期或者轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存率?；?放射治療即基因治療聯(lián)合放射治療通過其不同的抑瘤機制在乳腺癌治療中有著廣闊的前景。 IFN-γ由活性T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌,是第一個由基因工程生產(chǎn)的治療癌癥的細(xì)胞因子。 Endostatin(內(nèi)皮抑素)不僅被發(fā)現(xiàn)是有效力的血管生成抑制因子，而且被報道在臨床前期的腫瘤模型中有明顯的抑瘤效應(yīng)。 早期反應(yīng)生長基因1 (Egr-1)

3、 基因可由輻射誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，利用Egr-1 作為啟動子，IFN-γ 和 endostatin的基因表達(dá)可以被輻射誘導(dǎo)加強。,二、材料與方法,1.細(xì)胞系和實驗動物 小鼠乳腺腺癌細(xì)胞系4T1 購自美國 Type Culture Collection (Manassas, VA)公司。 雌性BALB/c小鼠(6-8-周齡，體重 16-20克)購自Harlan(Oxon, U.K.)2.小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型的建立小鼠左下腿處乳腺組織注射

4、1×105 的4T1 細(xì)胞。一周后當(dāng)小鼠腿部局部腫瘤生長到直徑大約5 mm時，小鼠被隨機分為5組。1組為空白對照組；2組為單純注射空質(zhì)粒(20 mg)；3組注射pEgr-IFN-γ + pEgr-endostatin質(zhì)粒；4組為單純局部接受8 Gy 放療；5組為局部接受8 Gy 放療聯(lián)合pEgr-IFN-γ + pEgr-endostatin 質(zhì)粒基因治療組。隔日用卡尺測量腫瘤大小，21天后殺死小鼠并取轉(zhuǎn)移的肺結(jié)節(jié)計數(shù)。另一組

5、動物做生存率的實驗。3.ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清和腫瘤組織勻漿中 IFN-g 和endostatin 的水平 4. Yac-1 和 4T1 cells 分別被用做評價NK and CTL 細(xì)胞毒活性的靶細(xì)胞。其細(xì)胞毒效應(yīng)用Cran ToxiLux 試劑盒檢測 (OncoImmunin, Gaithersburg, MD) 5.腫瘤組織中的微血管密度由兔抗鼠-CD31 單抗檢測 (BioLegend, San Diego, CA

6、) 并在40倍和200倍的光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。,三、結(jié) 果,1 體外照射不同劑量轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞的IFN-γ 和 endostatin的表達(dá)如圖1所示，2 到 20 Gy不同劑量的X射線照射轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞4小時后，IFN-γ 和 endostatin的表達(dá)呈劑量依賴性上升。(p<0.05), IFN-γ水平在5 Gy照射后達(dá)到峰值 (圖1A) ，而endostatin水平在10 Gy照射后達(dá)到峰值 (圖

7、 1B)。,,,圖1A 不同劑量照射后細(xì)胞上清中IFN- 的表達(dá),圖1B 不同劑量照射后細(xì)胞上清中endostatin 的表達(dá),2 體外照射不同時間轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞的IFN-γ 和 endostatin的表達(dá),,,5 Gy 照射后2, 4, 8, 16, 24, 48, and 72 h ，4T1細(xì)胞上清中IFN-γ 和 endostatin 濃度與對照組比較上升，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。見圖2A和2B。,圖2A

8、 5Gy照射后不同時間細(xì)胞上清中IFN- γ濃度的表達(dá),圖2B 5Gy照射后不同時間細(xì)胞上清中endostatin濃度的表達(dá),,3 IFN-γ和endostatin 基因治療和放射治療的抑瘤作用,IFN-γ和endostatin 基因聯(lián)合放射治療組小鼠的腫瘤生長速率和腫瘤/體重比較對照組明顯抑制(p<0.05)。此外，基因聯(lián)合放射治療組小鼠的腫瘤生長速率和腫瘤/體重比較單純基因治療組(p<0.001) 或單純放療組 (p

9、<0.001) 顯著降低。見圖3A和3B,,,圖3A 基因放射治療對腫瘤生長速率的影響,圖3B 基因放射治療對小鼠腫瘤/體重比的影響,,,圖4 基因放射治療對小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的影響,圖4可見，基因聯(lián)合放射治療組小鼠的肺結(jié)節(jié)數(shù)較對照組明顯降低(p<0.01)。由圖5可見，基因聯(lián)合放射治療組小鼠的生存率較對照組明顯降低(p<0.01)。,4 IFN-γ和endostatin 基因放射治療對小鼠肺結(jié)節(jié)和生存率的影響,圖5 基

10、因聯(lián)合放射治療對小鼠生存率的影響,5 聯(lián)合IFN-γ-endostatin 基因放射治療抑瘤作用的機制研究,,,,,圖6A 基因聯(lián)合放療后小鼠脾中CTL細(xì)胞活性,IFN-γ和endostatin 基因聯(lián)合放射治療組小鼠脾中的CTL和 NK細(xì)胞活性較對照組顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。如圖6A和6B。 此外，IFN-γ和endostatin 基因聯(lián)合放射治療組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的 TNF-a 水平也較對照組顯著升高（p&

11、lt;0.05)，見圖 6C。,圖6B 基因聯(lián)合放療后小鼠脾中NK細(xì)胞活性,圖6C 基因聯(lián)合放療后小鼠TNT-a細(xì)胞活性,6聯(lián)合IFN-γ-endostatin 基因放射治療抑瘤作用的機制研究,,,圖7 IFN-γ和endostatin 基因聯(lián)合放射治療對小鼠腫瘤血管密度的影響,如圖 7所示， IFN-γ和endostatin 基因聯(lián)合放射治療組小鼠腫瘤血管密度較對照組顯著降低（p<0.05)，,小 結(jié),總之, Endos