miR-199a通過靶向調(diào)控DDR1的表達(dá)抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞4T-1的轉(zhuǎn)移.pdf

1、乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤類型，緊隨肺癌之后，嚴(yán)重威脅女性健康。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但根本原因在于遺傳基因的改變，其中包括癌基因的過度活化和抑癌基因功能的抑制。乳腺癌的發(fā)生、生長、侵襲與轉(zhuǎn)移等發(fā)展階段都存在相應(yīng)的遺傳基因改變，都受到基因的調(diào)節(jié)。乳腺癌的主要致死原因在于其向腦部、肺部、肝臟及骨骼等部位的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此研究乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制對乳腺癌治療具有重要意義。當(dāng)今，乳腺癌的臨床治療方法主要有：手術(shù)療法、化學(xué)藥物療法、內(nèi)分泌療法以及生物分子靶向

2、療法。雖然化學(xué)藥物治療在一定程度上提高了乳腺癌患者的生存率，但是藥物抵抗的頻繁出現(xiàn)使得腫瘤治療困難重重。因此，生物分子靶向治療應(yīng)運(yùn)而生，開啟了乳腺癌治療的新篇章。探索乳腺癌發(fā)生、生長、侵襲與轉(zhuǎn)移等發(fā)展階段的分子機(jī)制，尋找新的生物分子治療靶點(diǎn)成為研究乳腺癌的重中之重。
　　miR-199家族包括miR-199-a1，miR-199-a2和miR-199b三個(gè)成員。miR-199a有兩個(gè)成熟序列：miR-199a-5p和miR-199

3、a-3p，分別位于人的19號染色體（miR-199-a1）和1號染色體（miR-199-a2）上。研究表明miR-199a在腫瘤細(xì)胞中存在過量表達(dá)或者表達(dá)量下調(diào)現(xiàn)象，提示miR-199a可以通過調(diào)控下游癌基因或者抑癌基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
　　DDR（discoidin domain receptor）家族包括2個(gè)成員：DDR1和DDR2，DDR2只有一個(gè)亞型，DDR1則分為5個(gè)亞型（DDR1a-DDR1e）。DDR1a

4、、DDR1b和DDR1c是具有活性的DDR1亞型，其中DDR1c是最長的DDR1亞型。DDR1d和DDR1e沒有激酶活性。DDR1在人和小鼠的很多組織中表達(dá)，尤其是腦部、肺部、腎臟和脾臟。研究表明DDR1通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與膠原的相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。DDR1在很多類型的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，如：乳腺癌、肺癌、腦癌、肝癌、淋巴瘤等。這一表達(dá)的失調(diào)和功能的改變與腫瘤的發(fā)展過程和腫瘤病人的預(yù)后不良密切相關(guān)。
　　在本研究

5、中，我們證實(shí)了miR-199a和DDR1在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用并驗(yàn)證了miR-199a通過靶向調(diào)控基因DDR1的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　實(shí)驗(yàn)一過表達(dá)miR-199a抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞4T-1的轉(zhuǎn)移
　　目的：觀察miR-199a在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用。
　　方法：構(gòu)建miR-199a的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-miR-199a，利用重組質(zhì)粒建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-199a的4T-1-Luc小鼠乳腺癌細(xì)胞系，并

6、通過QRT-PCR檢測技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。在體外，運(yùn)用 TranswellTM實(shí)驗(yàn)研究穩(wěn)定細(xì)胞系的遷移能力，分析 miR-199a對乳腺癌細(xì)胞遷移的作用；在體內(nèi)，將穩(wěn)定細(xì)胞系通過尾靜脈注射入免疫力正常的BALB/c小鼠體內(nèi)，利用熒光素酶活體成像實(shí)驗(yàn)觀察miR-199a對乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的作用，通過小鼠肺組織的H&E（hematoxylin and eosin）染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：過表達(dá) miR-199a的小鼠乳

7、腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功；在體外，過表達(dá)miR-199a抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移；在體內(nèi)，過表達(dá)miR-199a抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：miR-199a抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。
　　實(shí)驗(yàn)二 miR-199a對DDR1的調(diào)控關(guān)系研究
　　目的：證實(shí)DDR1是miR-199a的下游靶向調(diào)控基因。
　　方法：利用生物信息學(xué)網(wǎng)站分別預(yù)測人和鼠的miR-199a對 DDR1非翻譯區(qū)（3’UTR）的可能結(jié)合位點(diǎn)；克隆野生型D

8、DR13’UTR序列以及每一個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)突變后的突變型DDR13’UTR序列；利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-199a對DDR1的直接調(diào)控作用和靶向調(diào)控位點(diǎn)。
　　結(jié)果：miR-199a可以靶向下調(diào)野生型DDR1的表達(dá)；確定了miR-199a調(diào)控DDR1的靶向結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)論：DDR1是miR-199a的下游靶基因。
　　實(shí)驗(yàn)三 DDR1在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的生物學(xué)作用
　　目的：研究干涉DDR1的表達(dá)

9、對乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法：構(gòu)建 DDR1的干涉質(zhì)粒 shDDR1，并且包裝重組慢病毒。利用重組慢病毒建立干涉 DDR1表達(dá)的4T-1-Luc小鼠乳腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系，并通過 QRT-PCR和Western Blot技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞系內(nèi)DDR1的干涉情況。在體外，通過TranswellTM實(shí)驗(yàn)研究穩(wěn)定細(xì)胞系的遷移能力，分析 DDR1對乳腺癌細(xì)胞遷移的作用；在體內(nèi)，將穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)尾靜脈注射入免疫力正常的BALB/c小鼠體內(nèi)，利用熒光素酶

10、活體成像實(shí)驗(yàn)分析DDR1對乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的作用，通過小鼠肺組織的H&E染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：干涉DDR1表達(dá)的小鼠乳腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功；在體外，干涉DDR1的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移；在體內(nèi)，干涉 DDR1的表達(dá)能夠抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：干涉DDR1的表達(dá)能夠抑制小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。
　　實(shí)驗(yàn)四 miR-199的臨床意義研究
　　目的：研究miR-199與乳腺癌臨床預(yù)后的