MiR-200c通過(guò)靶向ZNF217與ZEB1抑制TGF-β信號(hào)并調(diào)控乳腺癌trastuzumab耐藥與轉(zhuǎn)移.pdf

1、背景：
　　目前，乳腺癌已經(jīng)成為最為主要的威脅女性生命健康的惡性疾病之一，該病防治是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）過(guò)表達(dá)于20％～25%乳腺癌，患者治療預(yù)后差，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，HER2已經(jīng)成為治療乳腺癌的重要靶點(diǎn)。曲妥珠單抗（trastuzumab，商品名：herceptin，赫賽?。┦前邢騂ER2的人源化單克隆抗體，在HER

2、2陽(yáng)性乳腺癌早期治療及轉(zhuǎn)移治療中取得較大成功。然而，trastuzumab耐藥以及由此而導(dǎo)致的潛在轉(zhuǎn)移性增加卻一直困擾臨床醫(yī)生。近年來(lái)，乳腺癌trastuzumab耐藥與乳腺癌轉(zhuǎn)移研究取得顯著進(jìn)步，然而，乳腺癌trastuzumab耐藥與轉(zhuǎn)移相關(guān)性及其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。
　　TGF-β信號(hào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用并扮演著雙重角色，一方面，其在腫瘤早期發(fā)揮增殖抑制與促凋亡作用，另一方面，其在腫瘤晚期可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞

3、發(fā)生并維持上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。此外，TGF-β信號(hào)在多種腫瘤放射與藥物治療抵抗中的作用逐漸引起重視，成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，TGF-β信號(hào)在腫瘤耐藥與轉(zhuǎn)移中具有重要作用，有望成為重要的腫瘤治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于TGF-β信號(hào)在乳腺癌 trastuzumab耐藥及伴隨潛在轉(zhuǎn)移性增加中的作用及其自身調(diào)控機(jī)制尚不明確。MiRNAs

4、是一類(lèi)小分子RNA，通過(guò)靶向調(diào)控蛋白質(zhì)而廣泛參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。因此，闡明miRNA在介導(dǎo)TGF-β信號(hào)調(diào)控HER2陽(yáng)性乳腺癌trastuzumab耐藥和轉(zhuǎn)移中的潛在作用及其分子機(jī)制，將為乳腺癌多重惡性表型的逆轉(zhuǎn)提供新的思路，對(duì)于乳腺癌臨床治療具有重要意義。
　　目的：
　　闡明miRNA參與TGF-β信號(hào)調(diào)節(jié)并調(diào)控乳腺癌trastuzumab耐藥與轉(zhuǎn)移的潛在作用機(jī)制，為trastuzumab耐藥或者轉(zhuǎn)移乳腺癌治療提供新的思

5、路。
　　方法：
　　通過(guò)持續(xù)加藥培養(yǎng)野生型（wide type，WT）乳腺癌細(xì)胞的方法建立體外乳腺癌trastuzumab耐藥(trastuzumab resistant，TR)細(xì)胞模型，MTT檢測(cè)分析乳腺癌WT與TR乳腺癌細(xì)胞對(duì)trastuzumab藥物敏感性。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分析WT與TR乳腺癌細(xì)胞非錨定依賴生長(zhǎng)能力；transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析WT與TR乳腺癌細(xì)胞侵襲能力；對(duì)WT與TR乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，實(shí)

6、時(shí)定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）檢測(cè)EMT轉(zhuǎn)錄因子水平，WB檢測(cè)EMT標(biāo)記分子，以觀察細(xì)胞誘發(fā)EMT。
　　WB檢測(cè)乳腺癌WT與TR乳腺癌細(xì)胞TGF-β信號(hào)激活狀態(tài)，qPCR與ELISA檢測(cè)分析TGF-β的表達(dá)。RNA干涉TGF-β受體Ⅱ（TGF-βreceptorⅡ，TGFBR2）后，MTT檢測(cè)TR乳腺癌細(xì)胞trastuzumab敏感性，transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TR乳腺癌細(xì)胞侵襲力，

7、qPCR檢測(cè)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平變化。
　　通過(guò)miRNA芯片分析篩選WT與TR乳腺癌細(xì)胞中顯著差異表達(dá)的miRNAs。MTT與流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)分析miR-200c對(duì)乳腺癌細(xì)胞trastuzumab敏感性的影響。Traswell與劃痕實(shí)驗(yàn)分析miR-200c對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響。形態(tài)學(xué)觀察分析與WB檢測(cè)分析 miR-200c對(duì) EMT形態(tài)及標(biāo)記分子的影響。WB檢測(cè)分析miR-200c對(duì)乳腺癌細(xì)胞TGF-β信號(hào)的影響

8、，qPCR與ELISA檢測(cè)分析miR-200c對(duì)TGF-β表達(dá)的影響。裸鼠體內(nèi)成瘤與肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分析miR-200c對(duì)乳腺癌在動(dòng)物體內(nèi)trastuzumab耐藥與轉(zhuǎn)移的影響。
　　軟件預(yù)測(cè)miR-200c靶蛋白并使用雙熒光素酶報(bào)告基因、qPCR及WB等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶標(biāo)驗(yàn)證。MTT與流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)驗(yàn)證靶蛋白對(duì)trastuzumab敏感性的影響，Traswell與劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，形態(tài)學(xué)觀察靶蛋白對(duì) E

9、MT形態(tài)影響，WB分析靶蛋白對(duì) EMT標(biāo)記分子的影響。QPCR、WB與ELISA方法分析細(xì)胞中是否存在調(diào)控乳腺癌trastuzumab耐藥的miR-200c/ ZEB1與miR-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式環(huán)路。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)對(duì)乳腺癌細(xì)胞施加5μg/mL trastuzumab持續(xù)藥物篩選約6個(gè)月，成功建立體外TR乳腺癌細(xì)胞模型。相較于WT乳腺癌細(xì)胞，MTT結(jié)果表明TR乳腺癌細(xì)胞對(duì)trastuzu

10、mab敏感性顯著減低；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)與transwell結(jié)果表明，TR乳腺癌細(xì)胞非錨定依賴生長(zhǎng)能力與侵襲力顯著增加；形態(tài)學(xué)觀察、WB檢測(cè)EMT標(biāo)記物、qPCR檢測(cè)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果均表明TR乳腺癌細(xì)胞發(fā)生并維持明顯EMT。
　　相較于WT乳腺癌細(xì)胞，WB結(jié)果表明，TR乳腺癌細(xì)胞TGF-β信號(hào)激活水平顯著升高；qPCR與ELISA結(jié)果表明，TR乳腺癌細(xì)胞TGF-βmRNA水平與分泌水平均顯著升高。SiRNA干涉TGFBR2后

11、，MTT結(jié)果表明TR乳腺癌細(xì)胞trastuzumab敏感性顯著提高，transwell結(jié)果表明TR乳腺癌細(xì)胞侵襲力顯著下降，qPCR結(jié)果表明TR乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子顯著下調(diào)。
　　MiRNA芯片結(jié)果表明miR-200c在TR乳腺癌細(xì)胞中降低最為顯著。MTT與流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，miR-200c可使TR乳腺癌細(xì)胞對(duì)trastuzumab敏感性顯著提高；transwell與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-200c可顯著降低

12、 TR乳腺癌細(xì)胞侵襲與遷移能力；形態(tài)學(xué)觀察與WB結(jié)果表明，miR-200c可有效逆轉(zhuǎn)TR乳腺癌細(xì)胞EMT；WB結(jié)果表明，miR-200c可顯著抑制TGF-β信號(hào)；qPCR與ELISA結(jié)果表明，miR-200c可顯著下調(diào)TR乳腺癌細(xì)胞中TGF-β2與TGF-β3的mRNA水平與分泌蛋白水平。裸鼠體內(nèi)成瘤與尾靜脈肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-200c可在體內(nèi)使 TR乳腺癌細(xì)胞對(duì)trastuzumab敏感性提高并抑制其轉(zhuǎn)移。
　　軟件預(yù)測(cè)

13、、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、qPCR及 WB結(jié)果表明，miR-200c直接靶向鋅指蛋白ZNF217與轉(zhuǎn)錄因子ZEB1。SiRNA干涉ZNF217與ZEB1均可逆轉(zhuǎn)TR細(xì)胞trastuzumab耐藥和EMT，并降低其侵襲與遷移能力。此外，qPCR、WB及ELISA結(jié)果表明乳腺癌中miR-200c、ZNF217、TGF-β、ZEB1共同構(gòu)成mi-R200c/ZEB1與miR-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式調(diào)節(jié)環(huán)路。
　

14、　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌誘發(fā)trastuzumab耐藥的同時(shí)，伴發(fā)EMT、非錨定依賴生長(zhǎng)能力與侵襲能力的增強(qiáng)等惡性表型。TGF-β信號(hào)同時(shí)在乳腺癌trastuzumab耐藥細(xì)胞的耐藥性、EMT及侵襲力增強(qiáng)等多種惡性表型的誘導(dǎo)與維持中具有重要作用。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c通過(guò)靶向ZNF217與ZEB1調(diào)控TGF-β信號(hào)，逆轉(zhuǎn)乳腺癌trastuzumab耐藥并同時(shí)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。最后，我們還發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，miR-