表達(dá)HCV-C抗原的重組腺病毒載體疫苗的實驗研究.pdf

1、目的:丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C vires,HCV)引起的慢性肝病,是一個全球性健康問題。目前,臨床上仍無有效的治療方法。因此,開發(fā)有效的預(yù)防和治療性HCV疫苗,就成了一個亟待解決的問題。
　　 HCV屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬,由于丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus HCV)有多種基因型以及基因型的高度變異性,尤其是包膜區(qū)基因變異更大,因此按傳統(tǒng)方式研制的HCV疫苗面臨著很多困難。將編碼目的

2、抗原的外源基因?qū)氡唤臃N者的各類型新型疫苗可望成為丙肝疫苗研發(fā)的一條新的思路。丙肝病毒核心區(qū)(C區(qū))是最為保守及穩(wěn)定的區(qū)域,有報導(dǎo)表明C抗原可誘導(dǎo)針對丙肝病毒的高水平特異性抗體應(yīng)答及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)活性細(xì)胞免疫,是研制HCVDNA疫苗的主要靶抗原之一。
　　 與質(zhì)粒載體相比,復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)(replication-deficientadenovirus vect

3、or system)具有進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力強,宿主范圍廣,極高的轉(zhuǎn)染效率,外源基因高表達(dá)以及病毒滴度高等特點,在疫苗載體選擇中表現(xiàn)出優(yōu)勢,成為極具應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體。本研究中我們利用以重組復(fù)制缺陷型腺病毒為載體以HCV C抗原作為有效的靶抗原構(gòu)建了可表達(dá)HCV核心蛋白(HCV core protein)的重組腺病毒rAd-C,以探索研制丙型肝炎病毒疫苗新的途徑。
　　 方法:1.目的基因的擴增與鑒定以重組質(zhì)粒pEGFP-HC

4、V/C為模板,擴增C目的基因。將擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-T/C。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及測序,篩選重組子。
　　 2.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/C將質(zhì)粒pGEM-T/C以合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,膠回收目的片段,并與經(jīng)同樣的限制性內(nèi)切酶雙酶切的pcDNA3.0質(zhì)粒載體連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/C。
　　 3.構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒將

5、質(zhì)粒pGEM-T/C以合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,回收目的片段,將目的片段與經(jīng)合適的限制性內(nèi)切酶雙酶切的腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定,獲得重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/C。
　　 4.重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒用內(nèi)切酶PmeI線性化,利用AdEasy系統(tǒng),經(jīng)兩步法分別在大腸桿菌BJ-5183與骨架載體pAdEasy-1進(jìn)行同源重組,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd/C。用PacⅠ酶切鑒定,

6、將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E-coli DH5α,以堿裂解法大量提取,并用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法進(jìn)行純化。
　　 5.重組腺病毒的包裝與擴增將重組腺病毒質(zhì)粒pAd/C用內(nèi)切酶Pac-Ⅰ線性化,以陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293(humanembryo kidney293derived cell line)細(xì)胞。并觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent—protein,GFP)

7、的表達(dá)。凍融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染HEK293細(xì)胞,逐日觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE),及有無彗星樣斑塊(FOCI)形成。并經(jīng)第三、四輪大量擴增,收集第四輪病毒液,用腺病毒純化試劑盒進(jìn)行純化。
　　 6.重組腺病毒滴度測定將293細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中細(xì)胞生長至70％-80％匯合時,以不同稀釋倍數(shù)的各代病毒液感染細(xì)胞,感染48小時后,以GFP陽性細(xì)胞計數(shù)法測定病毒滴度。病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)×

8、病毒液的稀釋倍數(shù)/病毒液量。
　　 結(jié)果:1.成功構(gòu)建了質(zhì)粒pGEM-T/C,限制性酶切鑒定及測序結(jié)果證明與預(yù)期結(jié)果相符合。
　　 2.成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/C,酶切分析證明符合預(yù)期設(shè)計。
　　 3.成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/C,限制性酶切結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計。
　　 4.成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd/C,用PacⅠ酶切得到約30Kb的大片段和一個4.5Kb的小片段,PC

9、R鑒定目的基因長度與預(yù)期值相符。
　　 5.經(jīng)293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后,熒光顯微鏡下觀察到報告基因GFP的表達(dá),重組腺病毒rAd/C包裝成功。初代病毒再次感染293細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察到了逐日明顯變化的細(xì)胞病變和熒光聚集,且感染細(xì)胞后的各代病毒液均有彗星樣熒光斑塊形成。
　　 6.重組腺病毒rAd/C大量擴增后病毒滴度達(dá)到:6.8×108pfu/ml。
　　 結(jié)論:本研究利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建并包