LRG47-Rv2031c共表達重組慢病毒載體疫苗的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　構(gòu)建LRG47/Rv2031c共表達重組慢病毒載體疫苗，使其能在巨噬細胞（MΦ）中特異性表達自噬誘導蛋白LRG47和結(jié)核分枝桿菌（MycobacteriumtuberculosisMtb)持留狀態(tài)下特異表達的免疫優(yōu)勢抗原Rv2031c。然后從分子、細胞水平探討其殺傷Mtb的效果及相關(guān)機制。
　　研究方法：
　　1.采用PCR的方法擴增出Rv2031c編碼基因和2031-LRG47基因片段，分別克隆入含巨

2、噬細胞特異性啟動子的慢病毒表達質(zhì)粒pLenti-146-GFP中，構(gòu)建重組慢病毒表達質(zhì)粒pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47，構(gòu)建成功后采用限制性內(nèi)切酶酶切和測序法進行鑒定。
　　2.分別將重組慢病毒表達質(zhì)粒pLenti,pLenti-146-GFP,pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47與慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2G，pSPAX2以一定比例共轉(zhuǎn)染293T細胞，72h后收集相應的病毒顆粒，并用

3、超濾離心管濃縮法濃縮所收集的病毒顆粒，獲得重組慢病毒LV-Lenti,LV-Lenti-146-GFP,LV-Lenti-2031,LV-Lenti-2031-LRG47。然后通過流式細胞儀的方法檢測LV-Lenti-146-GFP感染RAW264.7細胞后GFP陽性細胞的比例來獲取所包裝慢病毒的滴度，以確定后續(xù)研究中慢病毒感染的最適滴度。
　　3.將重組慢病毒LV-Lenti-146-GFP感染RAW264.7細胞，分別于感染后

4、的24h,48h,72h,96h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達情況，以選擇重組慢病毒感染RAW264.7細胞的最佳時間點，用于后續(xù)研究。并在選擇的最佳時間點通過熒光定量PCR和Western-blot的方法檢測巨噬細胞內(nèi)Rv2031c和LRG47的表達情況。
　　4.采用上述重組慢病毒感染RAW264.7細胞，72h后以MOI=5:1的比例分別感染H37RV和H37RV-GFP，感染4h后洗去未被巨噬細胞吞噬的菌并以此為0h，采

5、用流式細胞法檢測0h時巨噬細胞吞噬H37Rv-GFP的水平，然后分別在H37RV感染后的不同時間點用0.1％SDS裂解細胞，稀釋后涂于7H10固體平板，待菌落生長后計數(shù)，以檢測重組慢病毒對巨噬細胞殺傷Mtb能力的影響。
　　5.采用上述重組慢病毒感染RAW264.7細胞，72h后進行以下指標的檢測，以探討其對巨噬細胞影響的可能機制：（1）通過Western-blot的方法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達情況，采用Cyto-IDAu

6、tophagyDetectionKit試劑盒檢測各組細胞的自噬水平。（2）通過免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察Mtb與溶酶體的共定位情況。（3）采用流式細胞法檢測巨噬細胞表面MHCII，CD80的表達水平。
　　6.采用OVA致敏BALB/c小鼠，用于制備OVA致敏淋巴細胞。采用上述重組慢病毒感染小鼠腹腔巨噬細胞，48小時后加入OVA進行抗原荷載，72小時后加入OVA致敏的小鼠脾淋巴細胞進行混合培養(yǎng)，然后分別于混合培養(yǎng)后不同

7、時間檢測淋巴細胞的增殖和活化水平，以探討重組慢病毒對巨噬細胞抗原提呈能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.酶切和測序結(jié)果顯示，重組慢病毒表達質(zhì)粒pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47構(gòu)建成功。
　　2.重組慢病毒LV-Lenti，LV-Lenti-146-GFP，LV-Lenti-2031，LV-Lenti-2031-LRG47包裝成功，且通過檢測滴度在1-2×107TU/ml以上，可用于后續(xù)的研究

8、。重組慢病毒GFP表達時相的觀察結(jié)果顯示重組慢病毒感染RAW264.7細胞的最佳時間點為72h。
　　3.熒光定量PCR和Western-blot的檢測結(jié)果證實重組慢病毒攜帶的重組基因Rv2031c和LRG47均可在RAW264.7細胞中有效表達。
　　4.流式細胞術(shù)檢測荷菌量檢測結(jié)果表明，重組慢病毒感染不會顯著影響巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌的吞噬能力，但與對照組相比，LV-Lenti-2031-LRG47可顯著增強巨噬細胞對M

9、tb的殺傷功能。
　　5.與對照組相比，LV-Lenti-2031-LRG47可以顯著提高巨噬細胞的自噬水平，促進巨噬細胞內(nèi)Mtb與溶酶體的融合。
　　6.與對照組相比，LV-Lenti-2031-LRG47可以顯著提高巨噬細胞表面MHCⅡ和CD80的表達水平。同時，混合細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，LV-Lenti-2031-LRG47感染可顯著增強巨噬細胞活化淋巴細胞的能力。
　　結(jié)論：
　　1.本研究成功構(gòu)建了LRG4