人FcγRIIB慢病毒表達(dá)載體的制備及其功能初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建人FcγRⅡB慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體，檢測人FcγRⅡB慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體在HT-1080細(xì)胞表面可調(diào)控的穩(wěn)定表達(dá)，并初步研究其對(duì)B細(xì)胞功能的影響。
　　方法:以人mRNA為模版逆轉(zhuǎn)錄獲得FcγRⅡB基因片段，并將其克隆入慢病毒表達(dá)質(zhì)粒TRE，構(gòu)建TRE-FcγRⅡB慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒。將慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒調(diào)節(jié)質(zhì)粒Tet分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，分別包裝表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒，分別

2、測定表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒感染滴度。表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒共感染HT-1080細(xì)胞，經(jīng)梯度濃度強(qiáng)力霉素（Dox）誘導(dǎo)，免疫熒光染色檢測HT-1080細(xì)胞表達(dá)FcγRⅡB，實(shí)時(shí)定量PCR檢測FcγRⅡBmRNA表達(dá)，Western blot法檢測FcγRⅡB蛋白表達(dá)。表達(dá)病毒和調(diào)節(jié)病毒共感染Ramos細(xì)胞，經(jīng)1000 ng/mL強(qiáng)力霉素（Dox）誘導(dǎo)，免疫熒光檢測FcγRⅡB的表達(dá)和FcγRⅡB與SLE患者血清免疫復(fù)合物（IC）中IgGFc端的結(jié)

3、合能力。LPS刺激感染后的Ramos細(xì)胞，ELISA法檢測過表達(dá)FcγRⅡB對(duì)Ramos細(xì)胞分泌IgM抗體的影響。
　　結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，測序結(jié)果顯示插入片段堿基序列與GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100％。表達(dá)病毒滴度達(dá)106TU/mL，調(diào)節(jié)病毒滴度達(dá)105TU/mL，感染性良好。HT-1080細(xì)胞被病毒感染后經(jīng)Dox誘導(dǎo)表達(dá)FcγRⅡB，免疫熒光染色結(jié)果顯示FcγRⅡB能夠在HT-1080細(xì)