pNL-hHGF-EGFP慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及表達(dá).pdf

1、目的：
　　構(gòu)建含人肝細(xì)胞生長因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒載體，檢測hHGF基因的mRNA和蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，為研究hHGF基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1．選擇合適的酶切位點(diǎn)，將hHGF cDNA基因片段（包含有啟動(dòng)子和多聚腺苷酸A尾）從pUC-SRα-HGF載體酶切獲取，平端連接入慢病毒載體pNL-EGFP，構(gòu)建重組慢病毒載體pNL

2、-hHGF-EGFP。
　　2．將pNL-hHGF-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、ELISA方法檢測hHGF基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3．將pNL-hHGF-EGFP與輔助質(zhì)粒pHELPER、pVSVG以一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集48h、72h病毒上清，經(jīng)超濾濃縮后，測定病毒滴度，獲得高滴度慢病毒顆粒。
　　結(jié)果：
　　1．hHGF cDNA基因片段正確的克隆到pNL-EGFP慢病毒載

3、體上，電泳結(jié)果和酶切鑒定均能得到與理論大小相符合的片段，測序結(jié)果與Genebank序列完全一致。
　　2．pNL-hHGF-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后綠色熒光蛋白有表達(dá)，轉(zhuǎn)染24后RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中hHGF基因mRNA表達(dá)，轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞上清中HGF蛋白含量為52.72±13.09ng/ml。
　　3．三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞成功獲得慢病毒，測得病毒的滴度為1.5×106TU/ml。
　　結(jié)論：<