LRG47-EBP50基因共修飾的恥垢分枝桿菌治療性靶向載體疫苗的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　 構建LRG47/EBP50和LRG47/EBP50-RFP基因共修飾的恥垢分枝桿菌治療性載體疫苗,使之能靶向進入Mφ,以便于后續(xù)從分子和細胞水平研究其抗Mtb感染的效果和機制。有望克服潛伏感染、多重耐藥和再燃等結核病治療難題,為開辟一條結核病防治的新思路奠定理論基礎。
　　 研究策略與方法:
　　 1.利用RT-PCR從小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中擴增出EBP50基因、LRG47基因分別

2、克隆至pCDNA3.1中,送去測序。測序正確后,通過次序嚴密的分步克隆,將EBP50基因片段亞克隆入雙啟動子真核共表達質粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHⅠ位點中、將LRG47基因亞克隆入pBudCE4.1的KpnⅠ/XhoⅠ位點中、分枝桿菌復制子OriM基因亞克隆入pBudCE4.1的NheⅠ位點中,形成穿梭/共表達質粒pLEM并轉染人293T細胞中進行表達鑒定。通過RT-PCR和Westernblot對目標基因產物進行檢測。

3、
　　 2.利用PCR從pSIREN-DNA-DsRed-Express中擴增出RFP基因并克隆至pCDNA3.1的EcoRⅠ/XbaⅠ位點中,形成pCDNA3.1-RFP,利用PCR從pLEM中擴增出EBP50基因并克隆至pCDNA3.1的HindⅢ/EcoRⅠ位點,形成pCDNA3.1-EBP50②,測序正確后,將EBP50基因亞克隆至pCDNA3.1-RFP中。通過次序嚴密的分步克隆,將EBP50-RFP片段亞克隆入雙啟動

4、子真核共表達質粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHⅠ位點中、將LRG47基因亞克隆入pBudCE4.1的KpnⅠ/XhoⅠ位點中、分枝桿菌復制子OriM基因亞克隆入pBudCE4.1的MheⅠ位點中,形成穿梭/共表達質粒pERLO并轉染人293T細胞中進行表達。通過RT-PCR、熒光顯微鏡直接觀察和Westernblot對目標基因產物進行檢測。
　　 3.通過Westernblot檢測恥垢分枝桿菌Ms1-2c對腹腔巨噬細胞

5、(PDMs)內源性表達的EBP50、LRG47的影響。將pLEM、pERLO質粒電轉化恥垢分枝桿菌Ms1-2c,鑒定無誤后分別命名為rMS-pLEM、rMS-pERLO,擴增、洗滌后用于感染小鼠巨噬細胞RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細胞(PDMs),觀察其對巨噬細胞的靶向性。
　　 實驗結果:
　　 1.成功構建了攜帶小鼠EBP50基因、小鼠LRG47基因、分枝桿菌復制子OriM基因的共表達質粒pLEM,轉染入人293T

6、細胞中后通過RT—PCR、Westernblot等方法從轉錄和翻譯水平都檢測到了目標基因的表達產物。
　　 2.成功構建了攜帶小鼠EBP50-RFP表達基因、小鼠LRG47基因、分枝桿菌復制子OriM基因的共表達質粒pERLO,轉染入人293T細胞中后通過RT—PCR、熒光觀察和Westernblot方法均檢測到了目標基因的表達產物。轉染入小鼠RAW264.7中觀察到紅色熒光表達。
　　 3.Ms1-2c能促進小鼠腹腔巨

7、噬細胞內的EBP50、LRG47內源性表達。成功得到了靶向性良好的重組恥垢分枝桿菌rMS-pLEM、rMS-pERLO。
　　 結論:
　　 1.LRG47與EBP50能同時在真核細胞中表達出來。
　　 2.EBP50與RFP能融合表達,便于后續(xù)動物實驗中EBP50在巨噬細胞內的定位檢測。
　　 3.Ms1-2c能作為巨噬細胞的靶向性載體。
　　 4.Ms1-2c能上調巨噬細胞內內源性的EBP50