表達ppe25、ppe27基因重組恥垢分枝桿菌的免疫生物學(xué)特性研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)引起的一種以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，目前全球約有1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌。目前用于結(jié)核病預(yù)防的卡介苗(BCG)，只能對兒童肺結(jié)核起到有效的保護，對成人的保護效果不盡如人意。PE/PPE蛋白家族其編碼基因大約占整個結(jié)核分枝桿菌基因組的10％，這些蛋白被認為是參與宿主免疫的毒力因子，它們只存在

2、于致病的分枝桿菌中，預(yù)示著PE/PPE蛋白在該菌致病中可能發(fā)揮重要作用，但大部分PE/PPE蛋白的確切功能亟待闡明。本研究利用恥垢分枝桿菌表達結(jié)核分枝桿菌PPE25和PPE27蛋白，以初步探究其生化特性，與巨噬細胞的相互作用及其免疫特性，為結(jié)核病新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。1.表達pe25和ppe27基因重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建及鑒定
　　以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，采用PCR技術(shù)擴增ppe25和ppe27基因序列并添加FLA

3、G標(biāo)簽，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ppe25-flag和pMV261-ppe27-flag，經(jīng)測序鑒定正確后，將兩個重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài)，PCR鑒定表明重組菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)構(gòu)建成功。重組菌經(jīng)45℃30min誘導(dǎo)表達后，Western blotting結(jié)果表明，表達的融合蛋白PPE25和PPE27與抗FLAG標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性

4、的反應(yīng)，與預(yù)期條帶大小39.51 kD和37.9 kD一致。
　　2.表達ppe25和ppe27基因重組恥垢分枝桿菌生化特性的研究
　　利用7H9培養(yǎng)恥垢分枝桿菌及重組恥垢分枝桿菌，繪制生長曲線，結(jié)果表明重組恥垢分枝桿菌與親本菌株相比生長速率無明顯變化。為了研究PPE25和PPE27蛋白是否與結(jié)核分枝桿菌應(yīng)對多種壓力環(huán)境能力有關(guān)，檢測重組菌在SDS表面壓力和饑餓條件等體外壓力環(huán)境下生長情況。實驗證明PPE25和PPE27蛋白

5、定位在細胞表面，增加了對饑餓條件和表面壓力環(huán)境的耐受，但對酸性環(huán)境更加敏感。實驗還同時檢測了重組菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)在巨噬細胞內(nèi)的生存情況及對巨噬細胞的影響。研究證明PPE25和PPE27蛋白明顯增強恥垢分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的存活，并且引起巨噬細胞明顯的凋亡和細胞壞死(p＜0.05)。
　　3.表達ppe25和ppe27基因重組恥垢分枝桿菌的免疫生物學(xué)特性

6、研究
　　將重組恥垢分枝桿菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)分別尾部皮下免疫6周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為5×107CFU/只，免疫2周后進行二免，4周后測定重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。ELISA檢測免疫小鼠血清抗體水平，結(jié)果表明重組菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)免疫組能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對P

7、PE25、PPE27蛋白以及PPE25/27∶56-71多肽的特異性抗體?？贵w亞類測定表明，M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)以產(chǎn)生IgG1為主。分離小鼠淋巴細胞，利用Brdu法檢測淋巴細胞抗原特異性增殖指數(shù)(SI)，結(jié)果顯示，以PPE25、PPE27和PPE25/27∶44-52多肽刺激均能使免疫小鼠淋巴細胞發(fā)生增殖(p＜0.05)。研究中還檢測了免疫小鼠淋巴細胞分泌Thl型