表達(dá)HBV截短C基因融合前S1基因的恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的乙型肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染性疾病，目前全世界HBV持續(xù)感染者超過3.5億，我國(guó)約有1.2億感染者。約有25％的HBV持續(xù)感染者會(huì)發(fā)生肝纖維化，并有可能發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌。乙型肝炎沒有理想的治療方案，疫苗仍是目前控制HBV感染的有效手段。乙肝表面抗原(surfaceantigenofHBV,HBsAg)刺激產(chǎn)生的表面抗體(surfaceantibodyofHBV,H

2、BsAb)具有中和活性，可以預(yù)防HBV感染，20世紀(jì)80年代以來，真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的這種HBsAg疫苗在臨床廣泛應(yīng)用，但是接種人群中有5％～10％的個(gè)體免疫系統(tǒng)無應(yīng)答或低應(yīng)答，還有部分HBV變異株仍可感染接種者，因此HBV的新型疫苗研究是十分必要的。 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)所介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用在病毒感染的免疫應(yīng)答和痊愈過程中起核心作用。HBV的核心基因(coregene，C基因)

3、在不同亞型間最為保守，而且其編碼蛋白中CTL表位和構(gòu)象型B細(xì)胞表位廣泛存在，是比較理想的疫苗研究靶分子；保守的前S1基因(preS1gene，preS1基因)編碼蛋白含有HBV和肝細(xì)胞膜結(jié)合的位點(diǎn)，針對(duì)該片段的前S1抗體是除HBsAb之外的又一中和抗體。 分枝桿菌可有效表達(dá)同源或異源基因相關(guān)的抗原分子，以活菌免疫方式持續(xù)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的保護(hù)性免疫應(yīng)答。卡介苗(BacillusCalmetteGuerin，BCG)先用于該類疫苗

4、研究來防治結(jié)核，但它生長(zhǎng)緩慢和轉(zhuǎn)化效率低，恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis，M.S)生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)容易，轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高，近年來在多種病原微生物疫苗研究中得到了應(yīng)用。 本研究根據(jù)CTL表位和B細(xì)胞表位識(shí)別特征，以HBV截短C基因融合preS1基因?yàn)榛A(chǔ)，構(gòu)建了原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體和重組恥垢分枝桿菌，比較了重組恥垢分枝桿菌、基因免疫誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液應(yīng)答水平，探索了恥垢分枝桿菌運(yùn)載HBV相關(guān)

5、抗原的可行性，為進(jìn)一步研究HBV新型疫苗奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括： 1.HBV截短C基因融合preS1基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定以雙酶切方式從真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-C-preS1上獲得融合基因，再將它插入到經(jīng)相同雙酶切后的原核表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建了融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可高效表達(dá)目的基因，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物可見24kD的新生蛋白條帶，與預(yù)期相對(duì)

6、分子量相符。該表達(dá)蛋白以包涵體形式存在，親和層析法獲得了純化的該蛋白，蛋白印跡(Westernblot)和酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)顯示該純化蛋白可特異性結(jié)合抗體。 2.HBV截短C基因融合preSl基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立設(shè)計(jì)特異引物，從含有HBV全基因組的質(zhì)粒pCPl0中擴(kuò)增截短C基因和preSl基因，再將它們分別克隆到pcDNA3.1(-)真核質(zhì)粒，構(gòu)建了

7、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-C-preS1，酶切鑒定和測(cè)序分析確認(rèn)插入序列正確后，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染P815細(xì)胞，通過G418篩選得到了陽性細(xì)胞克隆。該細(xì)胞克隆經(jīng)RT-PCR可檢測(cè)到融合基因條帶，間接免疫熒光法可觀察到P815轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白，能穩(wěn)定表達(dá)融合基因的P815細(xì)胞系的建立為基因免疫(DNA免疫)和CTL殺傷分析奠定了基礎(chǔ)。3.HBV截短C基因融合preS1基因在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)及小鼠體內(nèi)免疫學(xué)特性研究

8、 設(shè)計(jì)特異引物，從含有HBV全基因組的質(zhì)粒pPCP10中擴(kuò)增截短C基因和preS1基因，再分別將它們克隆到分泌表達(dá)型穿梭載體pDE22，構(gòu)建了穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDE22-C-preS1，酶切鑒定和測(cè)序分析確認(rèn)插入序列正確后，將重組質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌內(nèi)，經(jīng)潮霉素抗性篩選和PCR方法鑒定出1株含融合基因的重組恥垢分枝桿菌。42℃熱誘導(dǎo)重組恥垢分枝桿菌，SDS-PAGE和Westernblot分析顯示截短C基因融合preS1基因在恥垢

9、分枝桿菌中可分泌表達(dá)。 以BALB/c小鼠為對(duì)象進(jìn)行免疫注射。免疫物分別為生理鹽水、pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒、重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-C-preS1、恥垢分枝桿菌和重組恥垢分枝桿菌。各組均免疫2次，每次間隔3周。前期重組恥垢分枝桿菌免疫組抗體滴度升高幅度低于基因免疫組(p＜0.05)，后者45天達(dá)到到峰值1∶5100，45天后重組恥垢分枝桿菌免疫組抗體滴度高于基因免疫組(p＜0.05)，前者抗體滴度第60天達(dá)到峰

10、值1∶6900，且維持時(shí)間較基因免疫組更長(zhǎng)(p＜0.05)；基因免疫組和重組恥垢分枝桿菌免疫組誘導(dǎo)的免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著差異，前者的刺激指數(shù)低于后者(p＜0.05)；重組恥垢分枝桿菌誘導(dǎo)的特異性CTL殺傷率最高為50.2％，基因免疫組誘導(dǎo)的特異性CTL殺傷率最高為31.6％，二者有顯著差異(p＜0.05)。 4.結(jié)論HBV截短C基因融合preS1基因可在恥垢分枝桿菌中表達(dá)；帶有融合基因的重組恥垢分枝桿菌可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生