副結(jié)核分枝桿菌hsp65基因的克隆、表達與免疫研究.pdf

1、副結(jié)核病(Paratuberculosis)是由副結(jié)核分枝桿菌即禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis，MAP)引起的一種以反芻動物為主要宿主的慢性增生性、頑固性腸炎和進行性消瘦為特征的傳染病，也稱Johne’s病。該病不僅使病畜的飼料報酬降低，產(chǎn)奶量和繁殖力下降，造成巨大的經(jīng)濟損失，而且還與人類的克隆氏(Crohn's)病存在潛在聯(lián)系，因此，愈來愈受到世界各國的廣泛

2、關(guān)注。目前，該病尚無經(jīng)濟有效的治療藥物，控制該病的主要措施是加強飼養(yǎng)管理和消除傳染源，即以變態(tài)反應(yīng)、ELISA、病原分離鑒定等方法進行檢疫，對檢出的陽性牛隔離與淘汰。此外，也可采用預(yù)防接種的方法來控制該病，即將MAP滅活或致弱后制成疫苗進行免疫，接種疫苗不僅使該病的臨床型病例減少90％，而且減少了亞臨床感染動物的數(shù)量和組織學(xué)或細菌學(xué)檢測陽性的病例。但是，菌苗接種后會干擾該病和結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)和血清學(xué)檢測，許多國家已經(jīng)禁止使用接種菌苗來控

3、制副結(jié)核病。因此，研究開發(fā)副結(jié)核病的新型疫苗勢在必行。 熱休克蛋白(HSPs)是生物體受到物理、化學(xué)、生物、精神等刺激時發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的高度保守的蛋白質(zhì)。根據(jù)分子量，將主要的熱休克蛋白分為5個家族：大分子量家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量家族。Hsp60作為一種分子伴侶，能協(xié)助變性、不可溶的凝聚蛋白重新恢復(fù)天然構(gòu)象，在許多病原體傳染過程中是免疫優(yōu)勢抗原。hsp65基因又名groEL2基因，其編碼

4、的蛋白是HSP60家族成員，不僅可作為分枝桿菌的主要保護性抗原，還具有幫助樹突狀細胞遞呈抗原等功能。Hsp10(GroES)作為輔分子伴侶，在GroLS指導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊過程中具有輔助其活性的作用，同時作為一種有效的T細胞抗原，能刺激機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應(yīng)答，使外周血單核細胞出現(xiàn)增殖反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-γ，是制備新型疫苗的候選抗原。 為了研發(fā)預(yù)防副結(jié)核病的新型疫苗尤其是DNA疫苗及相關(guān)蛋白功能，本研究選擇了MAP的主要保護性抗原Hs

5、p65蛋白，以副結(jié)核分枝桿菌C-2株染色體DNA為模板，以hsp65基因的特異性引物進行PCR擴增，獲得了1626bp的hsp65基因，通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T Vector中，以質(zhì)粒大小、酶切分析、PCR擴增及序列分析鑒定重組克隆，成功地構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pGEM-T-hsp65，以DNASTAR軟件分析了所克隆基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，結(jié)果表明，所獲得的hsp65基因與GenBank中MAPK-10株

6、該基因核苷酸大小完全一致，兩者核苷酸序列的同源性為99.1％，氨基酸序列的同源性為99.3％，表明該基因在副結(jié)核分枝桿菌中高度保守。進一步將pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至pET-32a(+)原核表達系統(tǒng)中，構(gòu)建了高效原核表達質(zhì)粒pET-32a-hsp65，在與之相匹配的E.coli BL21(DE3)表達菌株中，該質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了76Ku的融合蛋白。經(jīng)免疫印跡分析證實，該融合蛋白具有與副結(jié)核分枝桿

7、菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)的特性。 在上述研究的基礎(chǔ)上，為研究開發(fā)MAP主要保護性基因hsp65的DNA疫苗，將克隆質(zhì)粒p GEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至真核表達載體pVAX1中，成功構(gòu)建了真核表達重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65，并以陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染試劑將真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，通過熒光抗體和RT-PCR技術(shù)證實hsp65基因可以在哺乳動物細胞中表達，同時將pGEM-T-hsp65中

8、的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至pVAX1-hsp10中，成功構(gòu)建了真核表達重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65-10。 以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10重組質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，同時設(shè)pVAX1、生理鹽水為對照組。特異性抗體檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠體內(nèi)分別產(chǎn)生了針對Hsp65的特異性抗體，且二價基因免疫組的抗體水平高于單價基因。淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果顯示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10

9、免疫組的淋巴細胞增殖活性高于生理鹽水對照組，而pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10實驗組之間差異不顯著(P>0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T細胞檢測結(jié)果顯示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫組CD8+T細胞水平高于對照組，尚未達到統(tǒng)計學(xué)的顯著水平(P>0.05)，但也表明實驗組產(chǎn)生了較高的以MHCⅠ類分子遞呈的細胞免疫應(yīng)答，pVAX1-hsp65免疫組的CD4+、CD3+T細胞數(shù)量明顯高

10、于其它組。重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65-10免疫組小鼠的IFN-γ水平明顯高于對照組，pVAX1-hsp65免疫組的小鼠IFN-γ水平略高于對照組，均未達到統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平(P>0.05)，但結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10均使免疫小鼠產(chǎn)生了細胞免疫，而且二價基因的免疫效果優(yōu)于單價基因。 以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫豚鼠，同時設(shè)pVAX1和副結(jié)核分枝桿菌超聲