PCR技術檢測鹿結核病及HSP65基因的克隆與表達.pdf

1、本文為確定我國鹿群的結核病的流行情況，應用聚合酶鏈反應(PCR)對采自國內(nèi)某一地區(qū)鹿場屠宰點的79份鹿全血樣品進行檢測，結果表明鹿群的結核病陽性率為43.0％，其中還有結核分枝桿菌的感染，證明鹿群中仍然高發(fā)結核病。 為了有效預防和治療鹿結核病，以PCR檢測鹿結核病陽性分離菌株基因組DNA為模板，應用PCR方法擴增熱休克蛋白65(Hsp65)基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化與測序載體PMD18-T進行連接，轉化克隆宿主菌E.coliDH5a

2、中測序鑒定，結果堿基序列與GenBank上結核分枝桿菌HSP65堿基序列100％一致。將連接有HSP65基因的PMD18-T載體和原核表達載體pGEX-6P-1分別用EcoRI/SaLI雙酶切處理，回收純化后，連接構建重組表達載體，轉化克隆宿主菌E.coliDH5a中，經(jīng)酶切及PCR鑒定為陽性克隆后進一步測序鑒定，結果堿基、預測氨基酸序列均與HSP65完全一致，并具有正確的讀碼框，獲得的重組表達質(zhì)粒pGEX-HSP65可用于下步表達。

3、 大量提取重組質(zhì)粒pGEX-HSP65，將其轉化到表達宿主菌E.coliBL21中，鑒定為陽性克隆后，以1mMol/L終濃度的IPTG37℃誘導表達，SDS-PAGE電泳分析，表達的蛋白條帶大小約86kDa，與預期的結果相符，經(jīng)薄層掃描表達外源蛋白量占全菌體蛋白總量的30.7％。HSP65基因表達的融合蛋白GST-HSP65經(jīng)過Westernblot檢測，在86kDa處顯示了特異蛋白結合帶，表達的蛋白能被PCR檢測鹿結核呈陽性的血