分枝桿菌hsp65基因多態(tài)性與其對消毒劑抗性的關(guān)系研究.pdf

1、目的：1.建立分枝桿菌定量殺滅試驗方法，研究常用消毒劑對分枝桿菌的殺滅效果。 2.研究分枝桿菌hsp65基因多態(tài)性。 3.研究分枝桿菌hsp65基因多態(tài)性與其對消毒劑抵抗力之間的關(guān)系。 4.篩選出用于消毒劑對分枝桿菌消毒效果鑒定的參考試驗菌株。 5.初步建立毛細(xì)管電泳技術(shù)在用于分枝桿菌基因多態(tài)性研究的試驗方法，并對此方法做出初步評價。 方法：1.選擇草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、變黃分枝

2、桿菌、迪氏分枝桿菌、龜分枝桿菌膿腫亞種、無色分枝桿菌、蟾分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌弱毒株H37Ra和牛分枝桿菌共10株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，和含氯消毒劑、含碘消毒劑、過氧乙酸消毒劑、含戊二醛消毒劑、乙醇類消毒劑和甲酚消毒劑共6種消毒劑進(jìn)行研究。 2.依照我國《消毒技術(shù)規(guī)范》第三版對定量殺菌試驗的要求，采用小三角瓶振搖方法分散試驗分枝桿菌，建立了分枝桿菌懸液定量殺滅試驗。 3.采用建立的分枝桿菌定量殺滅試驗檢測各種試驗消毒劑對試驗

3、分枝桿菌的殺滅效果。 4.采用試劑盒提取分枝桿菌基因組DNA，按參考文獻(xiàn)設(shè)計引物對分枝桿菌的hsp65基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用限制性內(nèi)切酶BstEⅡ和HaeⅢ對所得的擴(kuò)增片段進(jìn)行酶解，用瓊脂糖凝膠電泳分析酶解片段的模式，獲取hsp65基因多態(tài)性。 5.以自行組裝的毛細(xì)管電泳裝置，用DNA分子量marker(pUC19DNA/MspI)的11個片段作為評價指標(biāo)，對色譜柱、電泳緩沖液、電泳電壓等條件進(jìn)行優(yōu)化。并采用已建

4、立的方法對分枝桿菌hsp65基因酶解片段進(jìn)行分離，采取激光誘導(dǎo)熒光檢測，計算其與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的相對遷移時間，以此對組分進(jìn)行長度鑒定。并與常規(guī)瓊脂糖電泳結(jié)果比較，初步評價該方法的有效性。 6.采用統(tǒng)計分析軟件SPSS11.0版分析各試驗分枝桿菌對消毒劑抵抗力的差異和其與hsp65基因多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)合定量殺菌試驗的結(jié)果，推薦用于消毒劑對分枝桿菌殺滅效果鑒定試驗的標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株。 結(jié)果：1.分枝桿菌懸液定量殺滅試驗1)分枝桿菌在改

5、良羅氏培養(yǎng)基斜面和在分枝桿菌干燥培養(yǎng)基斜面上均生長良好，此二種培養(yǎng)基對消毒劑作用后的分枝桿菌檢測能力也沒有顯著差異。 2)采用含吐溫80的稀釋液對分枝桿菌稀釋的效果比用相同濃度的PEG400稀釋的效果好、含0.1％和0.5％吐溫80的稀釋液稀釋效果沒有顯著差異。 3)采用內(nèi)裝碎玻璃小塊的小三角瓶振搖對分枝桿菌進(jìn)行分散，經(jīng)抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)試驗表明其分散效果較為滿意，可滿足殺滅試驗的要求。 2.消毒劑對分枝桿菌

6、的殺滅效果1)1％堿性戊二醛作用1min，對懸液中的試驗分枝桿菌殺滅率均大于99.90％，作用20min，對所有試驗分枝桿菌的殺滅率均為100％。 2)40mg/L有效碘的艾利克消毒劑作用5min，對懸液中的試驗分枝桿菌殺滅率均大于99.90％，作用20min，對所有試驗分枝桿菌的殺滅率均為100％。 3)40mg/L有效氯的TC-101溶液作用5min，對懸液中偶發(fā)分枝桿菌和龜分枝桿菌膿腫亞種以外的其它試驗分枝桿菌殺滅

7、率均大于99.90％，80mg/L有效氯的TC-101溶液作用10min，對懸液中偶發(fā)分枝桿菌和龜分枝桿菌膿腫亞種殺滅率均大于99.90％。 24)10％(v/v)甲酚皂稀釋溶液作用5min，對懸液中的試驗分枝桿菌殺滅率均大于99.90％，作用20min，對所有試驗分枝桿菌的殺滅率均為100％。 5)200mg/L過氧乙酸作用1min，懸液中所有試驗分枝桿菌的平均殺滅率大于99.90％；作用20min，對所有試驗分枝桿菌

8、的殺滅率均為100％。 6)60％(v/v)乙醇作用1min，懸液中所有試驗分枝桿菌的平均殺滅率大于99.90％；作用5min，對所有試驗分枝桿菌的殺滅率均為100％。 3.hsp65基因多態(tài)性分析顯示，試驗的10種分枝桿菌BstEⅡ酶解片段具有4種類型長度的多態(tài)性：325/120bp、245/220bp、245/140/80bp和245/120/80bp；而HaeⅢ酶解片段的多態(tài)性極度分散，除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(試驗

9、中的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌)外，沒有任何兩種分枝桿菌具有相同的多態(tài)性模式。 4.hsp65基因多態(tài)性與分枝桿菌對消毒劑抗性關(guān)系分析具有以上4種BstEⅡ酶解片段長度多態(tài)性中任何一種分枝桿菌對各種消毒劑的抵抗力與不具有該多態(tài)性模式的其它試驗分枝桿菌消毒劑抵抗力并沒有顯著差異。 5.毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測分析分枝桿菌基因多態(tài)性1)毛細(xì)管柱的直徑和長度、電泳電壓、電泳緩沖液等對DNA片段的分離效果有明顯影響。 2

10、)優(yōu)選出毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測分枝桿菌基因多態(tài)性的試驗條件為：采用內(nèi)徑為100μm、長50cm的毛細(xì)管柱，45mmol/LTBE溶液作為電泳緩沖溶液，進(jìn)樣電壓為10kV(進(jìn)樣時間為12s)，11kV的電泳電壓。 3)毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測分枝桿菌基因多態(tài)性方法與常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果基本一致，但與之相比，檢測靈敏度較高，能檢測出常規(guī)凝膠電泳無法檢出的小片段。 結(jié)論和討論：1.建立了簡單易行的分枝桿菌懸液定量殺滅試

11、驗方法，即采用含0.1％吐溫80的PBS作為分枝桿菌稀釋液，在內(nèi)裝碎玻璃小塊的小三角瓶中振搖對分枝桿菌進(jìn)行分散，采用改良羅氏培養(yǎng)基平板涂抹法檢測消毒劑作用后的殘存菌數(shù)，與未經(jīng)消毒作用的細(xì)菌陽性對照菌數(shù)相比，計算殺滅率。 2.不同的分枝桿菌對同種消毒劑的抵抗力并不完全相同，龜分枝桿菌膿腫亞種和偶發(fā)分枝桿菌對含氯消毒劑的抵抗力顯著強(qiáng)于其它試驗的分枝桿菌。 3.hsp65基因多態(tài)性分析顯示，試驗的10種分枝桿菌BstEⅡ酶解片

12、段具有4種類型長度的多態(tài)性：325/120bp、245/220bp、245/140/80bp和245/120/80bp；而HaeⅢ酶解片段的多態(tài)性極度分散，除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(試驗中的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌)外，沒有任何兩種分枝桿菌具有相同的多態(tài)性模式。 4.并沒有發(fā)現(xiàn)分枝桿菌對某種消毒劑的抗性與其hsp65基因多態(tài)性相關(guān)。 5.毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測分枝桿菌基因多態(tài)性方法與常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測靈敏度較