天津海河流域消毒劑抗性菌生物譜分析及抗性基因污染水平調(diào)查.pdf

1、研究背景:消毒是控制病原微生物傳播的主要措施，已廣泛應(yīng)用于人們的日常生活、醫(yī)院、食品加工、日化用品和畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面，但伴隨而來(lái)的細(xì)菌對(duì)消毒劑的抗性問題也引起了人們的重視。細(xì)菌對(duì)消毒劑產(chǎn)生抗性后，會(huì)出現(xiàn)選擇性細(xì)菌，即具有強(qiáng)的適應(yīng)性和抵抗力的細(xì)菌得以存活，從而出現(xiàn)更難以控制和治愈的感染，消毒劑抗性菌已是導(dǎo)致醫(yī)院院內(nèi)感染的主要因素。消毒劑抗性菌是指對(duì)常用消毒劑濃度不再敏感的菌株，也就是即在可以殺滅或抑制絕大部分細(xì)菌的消毒劑濃度下，消毒劑抗

2、性菌卻不能被殺滅或抑制。一般以分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）或最小殺菌濃度（MBC）與標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC或MBC對(duì)比進(jìn)行判定。
　　細(xì)菌對(duì)消毒劑產(chǎn)生抗性的機(jī)理主要包括固有性抗性和獲得性抗性兩個(gè)方面。固有性抗性主要是由細(xì)菌自身的某些結(jié)構(gòu)或性能所決定的，例如細(xì)菌芽孢可以阻止消毒劑進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，革蘭氏陰性菌因?yàn)槠浼?xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌不同而對(duì)消毒劑表現(xiàn)更強(qiáng)的耐受。獲得性抗性是指細(xì)菌從環(huán)境中獲得了某些消毒劑抗性基因，并且這些消毒劑抗性基

3、因在細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)而導(dǎo)致對(duì)消毒劑的抗性。消毒劑抗性基因按其表達(dá)方式主要分為質(zhì)粒介導(dǎo)表達(dá)和染色體介導(dǎo)表達(dá)兩類。目前，對(duì)消毒劑抗性基因研究較多的是 QAC基因家族，研究發(fā)現(xiàn)有八種 QAC基因可以由質(zhì)粒介導(dǎo)表達(dá)，包括 qacA/B、qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI以及sugE(p)，這些基因可以在細(xì)菌之間水平和垂直傳播。染色體介導(dǎo)表達(dá)的抗性基因 sugE(c)、emrE、ydgE/ydgF、mdfA，賦予了細(xì)菌對(duì)

4、QACs的抗性。消毒劑抗性基因可以在細(xì)菌之間接合轉(zhuǎn)移，其對(duì)環(huán)境微生物安全的影響不容忽視。
　　研究目的:本論文將以水環(huán)境微生物安全評(píng)價(jià)常用指標(biāo)菌——大腸桿菌為對(duì)照，以常用消毒劑——次氯酸鈉、碘伏和苯扎溴銨為研究對(duì)象，針對(duì)天津海河流域開展消毒劑抗性菌抗性水平評(píng)估，并分析消毒劑抗性菌的生物譜，了解主要消毒劑抗性基因的污染水平，為消毒劑抗性菌的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性

5、菌抗性水平評(píng)估：選擇天津海河流域不同地點(diǎn)采樣，以大腸桿菌ATCC25922為對(duì)照，選取次氯酸鈉、碘伏、苯扎溴銨3種消毒劑，通過MIC和MBC試驗(yàn)，開展消毒劑抗性菌的抗性水平研究，并利用PCR技術(shù)分析典型消毒劑抗性基因在消毒劑抗性菌中的檢出情況。
　　2.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性菌生物譜分析：針對(duì)天津海河流域不同斷面采樣點(diǎn)的水樣，對(duì)MIC和MBC試驗(yàn)樣品中最高消毒劑濃度下存活的抗性菌，利用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析不

6、同水樣對(duì)3種消毒劑的MIC和MBC試驗(yàn)樣品中消毒劑抗性菌的生物譜。
　　3.天津海河流域水環(huán)境中典型消毒劑抗性基因污染水平調(diào)查：正壓抽濾方法濃集水樣中細(xì)菌，利用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，采用SYBR GREEN染料法，對(duì)樣品中典型消毒劑抗性基因進(jìn)行定量檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:
　　1.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性菌抗性水平：ATCC25922對(duì)次氯酸鈉的MIC和MBC均為250 mg/L，

7、碘伏MIC為90 mg/L，MBC在90～120 mg/L，苯扎溴銨MIC和MBC均為60 mg/L。而各采樣點(diǎn)的次氯酸鈉MIC和MBC在850～1350 mg/L，碘伏MIC和MBC在120～270 mg/L，苯扎溴銨除南運(yùn)河外其他采樣點(diǎn)MIC和MBC在90～270mg/L，均高于對(duì)照菌株。而在24個(gè)MIC樣品中，qacA/B和qacG基因均未檢出；qacEΔ1基因檢出率為（10/24），qacE、emrE基因檢出率為（3/24），s

8、ugE(p)基因檢出率為（2/24），sugE(c)檢出率為（6/24），ydgE/ydgF檢出率為（7/24）。
　　2.天津海河流域消毒劑抗性菌的生物譜分析：在次氯酸鈉、碘伏和苯扎溴銨共計(jì)38個(gè)MIC和MBC樣品中，變形菌門和厚壁菌門檢出相對(duì)較多。在南運(yùn)河碘伏MIC中檢測(cè)到較高豐度的藍(lán)藻門和放線菌門，金剛橋苯扎溴銨MIC中也檢測(cè)到一定豐度的放線菌門。
　　次氯酸鈉MIC和MBC樣品中，檢出頻率相對(duì)較多的種屬有：芽孢桿菌屬

9、、假單胞菌屬、Jeotgalibacillus屬、枝芽孢桿菌屬以及賴氨酸芽孢桿菌屬。碘伏MIC和MBC樣品中，相對(duì)豐度較高的種屬有：假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、Synechococcus屬、乳酸桿菌屬。苯扎溴銨MIC和MBC樣品中，相對(duì)豐度較高的種屬有：假單胞菌屬、氣單胞菌屬、普羅維登斯菌屬、摩根菌屬、芽孢桿菌屬。
　　3.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性基因污染情況：水樣中季銨鹽類消毒劑抗性基因qacE、qacE△1和qa

10、cG基因在8個(gè)采樣點(diǎn)均有檢出，而qacA/B基因在8個(gè)采樣點(diǎn)均未檢出，ydgE和ydgF基因在上、中游采樣點(diǎn)均有檢出，sugE(c)、sugE(p)和emrE基因在南運(yùn)河、金剛橋、大光明橋和外環(huán)路4個(gè)采樣點(diǎn)檢測(cè)為陽(yáng)性。
　　qacE和qacE△1基因定量結(jié)果達(dá)到102-104拷貝/mL，qacG基因達(dá)到102-103拷貝/mL。染色體型消毒劑抗性基因sugE(p)、sugE(c)、emrE可以達(dá)到100～103拷貝/mL，而ydg