結核桿菌eis基因重組恥垢分枝桿菌的構建及其胞內(nèi)活力研究.pdf

1、目的:
　　 全球有1/3的人口被結核分枝桿菌(MTB)感染,但只有10％左右的感染者發(fā)生結核病,而絕大多數(shù)是以潛伏持留感染形式存在。持留狀態(tài)的結核菌是產(chǎn)生結核菌潛伏感染、內(nèi)燃復發(fā)、長期治療、耐藥性結核等一系列問題的根本原因,當機體免疫力降低時結核持留菌又開始生長繁殖,導致活動性結核病成為人類健康的主要威脅之一。因此,研究MTB進入代謝或休眠持留期和在持留狀態(tài)下存活的機制,進而尋找抑制其進入持留期和殺滅結核持留菌的方法,對于控制

2、和根除結核病具有重要意義。
　　 現(xiàn)目前關于結核持留方面的研究有很多,主要圍繞MTB與宿主巨噬細胞相互作用方面的研究,但是至今我們還是沒有得到最明確的MTB持留生存的機制,這也是至今為什么未找到治療結核菌持留感染的方法的關鍵所在。MTB基因者組全序列的闡明及分子生物學技術的發(fā)展為闡明MTB持留現(xiàn)象的分子機制提供了有效的手段,研究發(fā)現(xiàn)MTB進入巨噬細胞后存在特殊的基因表達以適應胞內(nèi)環(huán)境,但是確定哪些或者哪一個特定基因從本質(zhì)上調(diào)控了

3、MTB持留性,有待進一步的研究證實。
　　 平板菌落計數(shù)法是檢測判斷細菌活力的常用方法,但是這種方法操作繁雜,況且分枝桿菌生長緩慢(MTB生長周期為4-8周,恥垢分枝桿菌也要3-4 d),不能滿足科研工作的時效性。流式細胞儀與FDA染色法相結合檢測胞內(nèi)分枝桿菌,不僅操作簡單,而且能在24 h內(nèi)得出結果,對提高分枝桿菌藥敏實驗研究及結核病的預防和診斷具有重要意義
　　 我們研究的是:選擇致病性H37Rv菌株的eis基因,定

4、向克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體pMV261中,利用電穿孔方法將其導入M.S mc2155中,篩選穩(wěn)定表達的重組菌株;選擇流式細胞儀,利用構建成功的重組M.S感染U937巨噬細胞,吞噬作用后收集胞內(nèi)細菌,用FDA熒光染料染色后經(jīng)流式細胞儀檢測,并與平板菌落計數(shù)法比較兩者檢測結果,建立一種檢測結核持留菌快速而有效的方法。為下一步胞內(nèi)重組M.S的生存機制及抗持留菌藥物研究奠定基礎。
　　 方法:
　　 1.首先,根據(jù)G

5、enbank中eis基因(GeneID:885903)編碼序列設計引物,在設計的引物兩端分別加上限制性內(nèi)切酶識別位點。提取結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA,以之為模板進行PCR擴增,獲得eis基因。
　　 2.雙酶切PCR產(chǎn)物和大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒pMV261,電泳回收目的基因片段和載體。用T4 DNA連接試劑盒連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,在含Kan的LB平板上篩選陽性克隆,重組質(zhì)粒命名為pMV-eis。酶

6、切和測序鑒定eis克隆的準確性。
　　 3.制備M.S感受態(tài)細胞,以空白質(zhì)粒pMV261作為對照。利用電穿孔的方法將質(zhì)粒導入到感受態(tài)M.S中,經(jīng)Kan抗性篩選,限制性酶切分析等鑒定構建成功的重組M.S菌株。用SDS-PAGE和Western blot分析eis基因在恥垢分枝桿菌中的誘導表達。
　　 4.重組M.S胞內(nèi)活力檢測研究:調(diào)整U937細胞和重組M..S的濃度,按一定的比例以重組M.S感染U937細胞,以負載pMV

7、261空質(zhì)粒的M.S為對照,分別于4、12、24、48 h收獲細胞。以含0.1%TritonX-100的PBS裂解細胞,收集胞內(nèi)細菌。獲得的胞內(nèi)細菌用流式細胞儀和FDA染色法檢測判斷重組M.S在胞內(nèi)的活力,并與平板菌落計數(shù)法進行比較。
　　 結果:
　　 1.設計了eis引物,采用PCR方法從H37Rv基因組中擴增出相應大小的目的基因片段,將其與大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒pMV261連接,限制性酶切和測序鑒定穿梭表達

8、載體構建成功。
　　 2.將成功構建的重組質(zhì)粒利用電穿孔的方法轉(zhuǎn)入M.S mc2155中,經(jīng)Kan抗性篩選、限制性酶切分析鑒定重組M.S構建成功。采用SDS-PAGE和Western blot證實eis能在M.S中成功表達。
　　 3.篩選穩(wěn)定表達的菌株,按MOI=10:1的比例以重組M.S感染U937細胞。用流式細胞儀檢測經(jīng)FDA染色的胞內(nèi)細菌。結果顯示:感染4 h后,胞內(nèi)重組M.S細菌的死亡率與負載空質(zhì)粒的M.S對照

9、組無明顯差異。但隨著時間的延長,感染12、24、48 h后,前者的死亡率明顯低于后者對照組。
　　 4.按MOI=10:1的比例以重組M.S感染U937細胞,使用公式:死亡率=[1—(未被吞噬細菌量+胞內(nèi)活菌量)/感染用總菌量]×100%,得出平板菌落計數(shù)法獲得的重組M.S在胞內(nèi)的死亡率,與流式細胞儀結果比較。結果顯示:流式細胞儀判斷結果與平板菌落計數(shù)法一致,兩者差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1.成功構

10、建了pMV-eis大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒;
　　 2.成功將pMV-eis電轉(zhuǎn)化入M.S中,構建了重組M.S。
　　 3.SDS-PAGE成功的檢測到M.S能誘導表達eis基因產(chǎn)物Eis蛋白,Western blot證實所表達的蛋白具有一定的免疫原性。
　　 4.流式細胞儀證實eis基因能增強重組M.S在胞內(nèi)持留,與平板菌落計數(shù)法判斷結果一致。流式細胞術與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比具有快速、敏感、方便的特點,可