一種新型的疫苗載體——重組桿狀病毒用于日本血吸蟲DNA疫苗的研究.pdf

1、目前血吸蟲DNA疫苗在抗血吸蟲疫苗研究中占據(jù)著主導(dǎo)地位。質(zhì)粒載體是最常用的DNA疫苗載體，由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低，影響了編碼抗原的有效表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體不能誘導(dǎo)足夠有效的免疫應(yīng)答，因此難以取得理想的抗血吸蟲感染的保護(hù)效果。同時質(zhì)粒載體的容量較小可能會影響到大片段抗原分子和多價疫苗的應(yīng)用。如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果已成為當(dāng)前抗血吸蟲疫苗研究的重點。 病毒載體中的哺乳動物病毒載體如痘苗病毒和腺病毒載體也可用于構(gòu)建DNA疫苗，雖然哺乳動物

2、病毒載體克服了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率和容量的不足，但由于自身的免疫原性和體內(nèi)存在針對這些病毒載體的抗體，應(yīng)用上也受到了限制。因此發(fā)展新的疫苗載體必將有助于血吸蟲疫苗的研究。 而桿狀病毒屬于昆蟲病毒，動物體內(nèi)缺乏預(yù)先存在的抗體。桿狀病毒載體除具備常用病毒載體的優(yōu)勢外，還具有低毒、安全、制備簡單和易于得到高滴度的病毒粒子等優(yōu)點，這些為桿狀病毒開發(fā)成DNA疫苗的載體提供了理論基礎(chǔ)。在偽狂犬病病毒、丙型肝炎病毒和鼠瘧疾伯氏瘧原蟲研究中，重組桿狀

3、病毒介導(dǎo)的外源基因的表達(dá)也能引起機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，這些為桿狀病毒開發(fā)成DNA疫苗的載體提供了實驗依據(jù)。 此外，DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫也可以提高DNA疫苗的免疫效果。本研究選用日本血吸蟲26kDa谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Sj26)作為抗原分子，一方面探討桿狀病毒作為日本血吸蟲DNA疫苗載體的可行性；另一方面觀察DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫的協(xié)同作用。 一、日本血吸蟲Sj26重組質(zhì)粒DNA疫苗和重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫的保

4、護(hù)作用研究目的：觀察含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的真核表達(dá)載體pEGFP-N3構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26的體外表達(dá)、免疫保護(hù)效應(yīng)及其與日本血吸蟲26kDa谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶重組蛋白(rSj26GST)聯(lián)合免疫對小鼠抗日本血吸蟲感染的保護(hù)作用。 方法：PCR擴(kuò)增Sj26基因并連入T載體進(jìn)行序列測定，正確重組的質(zhì)粒命名為pT1-Sj26。再將Sj26基因定

5、向克隆入含有EGFP的真核表達(dá)載體pEGFP-N3，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26。pEGFP-Sj26體外轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎(babyhamsterkidney,BHK)細(xì)胞，用熒光顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)檢測蛋白表達(dá)。60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E5組，每組12只，每只小鼠均免疫3次，間隔2周。A組為PBS對照組，B組為pEGFP-N3組，C組為pEGFP-Sj26組，D組為rSj26GST組，E

6、組為pEGFP-Sj26+rSj26GST聯(lián)合免疫組。聯(lián)合免疫組先用pEGFP-Sj26免疫2次，再用rSj26GST加強(qiáng)免疫1次。以上各組均于末次免疫后2周進(jìn)行攻擊感染，感染45d后剖殺，計數(shù)蟲荷和肝內(nèi)蟲卵數(shù)，計算減蟲率和肝組織中每條雌蟲減卵率。結(jié)果：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入T載體測序結(jié)果顯示Sj26基因與文獻(xiàn)報道的序列一致性為100％。重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26構(gòu)建正確并成功轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達(dá)，Western

7、blot證實了pEGFP-Sj26能夠表達(dá)Sj26-EGFP融合蛋白。動物保護(hù)性實驗顯示，pEGFP-Sj26和rSj26GST聯(lián)合免疫組的減蟲率為50.8％，顯著高于pEGFP-Sj26單獨免疫組(28.0％)和rSj26GST單獨免疫組(25.5％)。聯(lián)合免疫組、rSj26GST組和pEGFP-Sj26組減卵率分別為32.7％、33.0％和20.6％。與PBS對照組相比，聯(lián)合免疫組和rSj26GST單獨免疫組肝組織中每條雌蟲產(chǎn)卵數(shù)差

8、異有顯著性(P＜0.01)，pEGFP-Sj26單獨免疫組差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26能成功地在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)；重組質(zhì)粒DNA疫苗(pEGFP-Sj26)免疫對小鼠具有保護(hù)作用；pEGFP-Sj26和重組蛋白疫苗(rSj26GST)聯(lián)合免疫可以增強(qiáng)小鼠抗日本血吸蟲感染的保護(hù)作用。 轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK細(xì)胞后，Westernblot證實重組桿狀病毒能夠在BHK細(xì)胞中表

9、達(dá)Sj26GST蛋白。 動物保護(hù)性實驗顯示，vAcCMVSj26免疫小鼠后獲得了28.3％的減蟲率和23.6％的減卵率，與空病毒和攻擊感染對照組比較，差異有顯著性。vAcCMVSj26和rSj26GST聯(lián)合免疫組的減蟲率為44.0％，明顯高于vAcCMVSj26單獨免疫組(22.7％)和rSj26GST單獨免疫組(25.6％)。聯(lián)合免疫組、rSj26GST組和vAcCMVSj26組減卵率分別為25.5％、33.0％和23.9％，

10、與PBS對照組相比，肝組織中每條雌蟲產(chǎn)卵數(shù)差異有顯著性(P＜0.05或0.01)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Sj26重組桿狀病毒；Sj26重組桿狀病毒能夠在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)Sj26GST蛋白；桿狀病毒可以作為日本血吸蟲DNA疫苗的載體；重組桿狀病毒介導(dǎo)的Sj26DNA疫苗(vAcCMVSj26)和重組蛋白(rSj26GST)疫苗聯(lián)合免疫可以產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用。 課題的特色和創(chuàng)新點： 1)用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)

11、載體pEGFP-N3構(gòu)建了日本血吸蟲26kDa谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Sj26)的重組質(zhì)粒DNA疫苗(pEGFP-Sj26)。本研究重組的質(zhì)粒能夠借助報告基因來顯示目的基因Sj26在體外哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)情況。 2)重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26免疫小鼠后能產(chǎn)生一定的抗日本血吸蟲感染的保護(hù)作用。3)首次構(gòu)建了以桿狀病毒為載體的日本血吸蟲DNA疫苗并證實其在哺乳動物細(xì)胞中能有效表達(dá)。 4)首次證明了重組桿狀病毒介導(dǎo)的DNA疫苗能產(chǎn)