日本血吸蟲(chóng)TOR分子DNA疫苗和RNA干擾研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是一種慢性消耗性寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重影響發(fā)展中國(guó)家的公共衛(wèi)生安全。日本血吸蟲(chóng)病在我國(guó)南方廣泛流行，對(duì)人民身體健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)等造成了重大損害。血吸蟲(chóng)具有免疫逃避特性，可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用是機(jī)體抵抗病原微生物及人體寄生蟲(chóng)感染的重要防御機(jī)制。血吸蟲(chóng)具有多種調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體活性的機(jī)制。研究表明，四跨膜孤兒受體(TOR)蛋白是一種位于血吸蟲(chóng)體被表面的補(bǔ)體C2抗原受體，可以通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體C2a分子抑制補(bǔ)體活性。
　　本文利用P

2、CR技術(shù)擴(kuò)增到日本血吸蟲(chóng)SjTOR完整的蛋白編碼區(qū)1245bp，將其克隆到pXJ40-FLAG載體的HindⅢ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用間接免疫熒光染色可觀察到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞有特異性綠色熒光，空質(zhì)粒對(duì)照則未見(jiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pXJ40-FLAG-TOR質(zhì)粒6h后SjTOR基因已有轉(zhuǎn)錄，至轉(zhuǎn)染24 h時(shí)轉(zhuǎn)錄

3、水平最高，隨后開(kāi)始降低。Western blot結(jié)果顯示SjTOR蛋白分子量約53kDa，可被抗FLAG單抗和抗rSjTOR-ED1抗血清識(shí)別。結(jié)果表明SjTOR蛋白可以在293T細(xì)胞中表達(dá)。
　　以構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR為基礎(chǔ)大量制備DNA疫苗，分別利用肌肉注射法和電導(dǎo)入法免疫昆明系和BALB/c小鼠。在昆明鼠中，和空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，用電導(dǎo)入法免疫DNA疫苗誘導(dǎo)了25％的減蟲(chóng)率和28.87％的減卵率;肌

4、肉注射法誘導(dǎo)了0.12％的減蟲(chóng)率和42.38％的減卵率。在BALB/c小鼠中，和空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，用電導(dǎo)入法免疫DNA疫苗獲得了22.58％的減蟲(chóng)率和32.6％的減卵率;而肌肉注射法獲得了20.58％的減蟲(chóng)率和51.34％的減卵率。ELISA結(jié)果表明電導(dǎo)入法免疫在昆明系和BALB/c小鼠均誘導(dǎo)了較高水平的特異性IgG抗體，且至剖殺時(shí)依然保持較高水平，而肌肉注射法免疫小鼠后特異性IgG抗體水平?jīng)]有明顯升高。電導(dǎo)入法免疫的昆明系和BALB

5、/c小鼠特異性IgG1抗體水平都沒(méi)有升高，而肌肉注射法免疫后均有顯著升高。和對(duì)照組相比，各免疫組小鼠的IgG2a抗體水平升高均不明顯。液相芯片技術(shù)檢測(cè)免疫組小鼠血清細(xì)胞因子水平，結(jié)果與PBS對(duì)照組相比，肌注免疫和電導(dǎo)入法免疫BALB/c和昆明系小鼠可誘導(dǎo)其血清IL-12和IFN-γ水平升高，IL-4和IL-10水平則降低。結(jié)果表明，pXJ40-FLAG-TORDNA疫苗免疫可能誘導(dǎo)了趨向Th1型的免疫應(yīng)答。
　　根據(jù)SjTOR基因

6、設(shè)計(jì)和合成了4對(duì)siRNA分子。在培養(yǎng)的293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染siRNA和pXJ40-FLAG-TOR質(zhì)粒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示S1、S2、S3、S4 siRNA分子分別誘導(dǎo)SjTOR基因轉(zhuǎn)錄水平降低了70％、63％、3.63％、43％。將S1、S2、S4 siRNA分子通過(guò)小鼠尾靜脈注射進(jìn)行體內(nèi)RNA干擾試驗(yàn)，結(jié)果與DEPC H2O組相比， siRNA誘導(dǎo)SjTOR基因的轉(zhuǎn)錄水平分別下降84.7％、80.9％和23％。蟲(chóng)荷數(shù)和

7、肝臟組織蟲(chóng)卵數(shù)分別減少了6.07％和10.06％、24.24％和44.27％、14.02％和63.18％。結(jié)果表明，特異的siRNA分子可以在體內(nèi)干擾SjTOR基因的表達(dá)，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)顯著的減蟲(chóng)減卵率。
　　綜上，本文構(gòu)建的pXJ40-FLAG-TOR真核表達(dá)質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞中表達(dá)，免疫小鼠可以誘導(dǎo)趨向Th1型的免疫反應(yīng)和顯著的免疫保護(hù)效果。利用S4 siRNA分子進(jìn)行的RNA干擾試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，SjTOR基因可能在日本血吸蟲(chóng)免