日本血吸蟲成蟲細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及童蟲傳代細(xì)胞與DNA疫苗聯(lián)合免疫的研究.pdf

1、目的 觀察與鑒定用RPMI-1640-40特定培養(yǎng)基對日本血吸蟲30d成蟲全細(xì)胞體外培養(yǎng)的效果；體外培養(yǎng)獲得血吸蟲童蟲傳代細(xì)胞和重組技術(shù)構(gòu)建血吸蟲鐵蛋白DNA疫苗(proVAX-GMCSF-SjFer)進(jìn)行聯(lián)合免疫觀察其保護(hù)性效果。 方法 用RPMI-1640-40特定培養(yǎng)基對日本血吸蟲尾蚴感染小鼠30d成蟲全細(xì)胞作體外原代和傳代培養(yǎng)；動態(tài)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)、一般形態(tài)和凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞活力；用細(xì)胞計數(shù)法測定生長曲線和分裂

2、指數(shù)；用堿性磷酸酶(AKP)染色、超微結(jié)構(gòu)觀察和染色體核型分析等指標(biāo)鑒定傳代細(xì)胞的培養(yǎng)質(zhì)量。選擇日本血吸蟲肝門型早期童蟲細(xì)胞，用RPMI-1640-40特定培養(yǎng)基作體外原代和傳代培養(yǎng)，獲得第4代培養(yǎng)細(xì)胞。從GenBank中查找日本血吸蟲鐵蛋白與粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的基因編碼序列，設(shè)計含有EcoRI和NotI酶切位點引物，在已構(gòu)建好的pGMC／SjFer重組質(zhì)粒上擴(kuò)增GMCSF-sjFer基因，產(chǎn)物經(jīng)雙酶切回收后定向克隆到真核表達(dá)載

3、體proVAX中，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，構(gòu)建proVAX-GMCSF-sjFer DNA疫苗。童蟲培養(yǎng)細(xì)胞和DNA疫苗聯(lián)合免疫的保護(hù)性實驗設(shè)計：選用雌性昆明鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組，10只／組。A組(O.9％NaCI 100μl／鼠、)；B組(童蟲細(xì)胞1×10<'6>個／鼠)；C組(童蟲細(xì)胞1×100<'6>個和oroVAX-GMCSF-SjFer 100μg／鼠聯(lián)合免疫)；D組(proVAX-GMCSF-SjFer

4、100μg／鼠)；E組(proVAX 100μg／鼠)。童蟲培養(yǎng)細(xì)胞作腹腔接種，質(zhì)粒DNA作肌肉注射。按0、2、6W設(shè)計共接種3次。末次接種后第2W，經(jīng)腹部感染尾蚴40±2條／鼠。感染后第42d剖殺，計數(shù)每鼠蟲荷和每克肝卵數(shù)。 結(jié)果用RPMI-1640-40特定培養(yǎng)基對日本血吸蟲30d成蟲細(xì)胞作體外培養(yǎng)的結(jié)果顯示：培養(yǎng)細(xì)胞呈半懸浮聚集生長狀態(tài)；原代和傳4代內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞以及凍存復(fù)蘇細(xì)胞的存活率在90％以上；培養(yǎng)細(xì)胞的一般形態(tài)多呈圓形

5、或橢圓形，少數(shù)為不規(guī)則或多邊形及梭形，大小約為3.0～15.5μm×2.5～12.0μm，可見生長旺盛的發(fā)亮細(xì)胞和成對細(xì)胞分裂相；傳5代內(nèi)的細(xì)胞生長繁殖速度較快，5代后有所減慢；傳5代細(xì)胞的染色體符合日本血吸蟲的二倍體核型，數(shù)目為8對16條；傳5代細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)既顯示有形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的4類細(xì)胞，也顯示出至少3種異常形態(tài)的細(xì)胞。DNA疫苗構(gòu)建結(jié)果顯示：對重組質(zhì)粒proVAX-GMCSF-SjFer進(jìn)行PCR和雙酶切，獲得一條大小約為960b

6、p的目的片段和兩條酶切片段。保護(hù)性免疫結(jié)果顯示：童蟲培養(yǎng)細(xì)胞組與對照組相比，減蟲率和減卵率分別為35.71％和46.85％；proVAX-GMCSF-SjFer組與proVAX組比，減蟲率和減卵率分別為22.46％和29.40％；童蟲細(xì)胞與proVAX-GMCSF-SjFer聯(lián)合免疫組與對照組相比僅獲得29.00％的減蟲率和35.53％的肝卵減少率；在B、C和D組均檢測到抗血吸蟲抗體，其中B組的抗體水平為最高。 結(jié)論 用RPMI