日本血吸蟲脫尾活童蟲表膜結(jié)合肽的親和篩選與功能鑒定.pdf

1、血吸蟲病是一種重要危害人類身體健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的寄生蟲病，是世界主要公共衛(wèi)生問題之一。當(dāng)前，用于血吸蟲病防治的方法，盡管有抗病原藥物-吡喹酮用于人、畜化療以控制病情和減少傳染源，有殺中間宿主的氯硝柳胺等遙藥用于人畜活動(dòng)頻繁的易感地帶滅螺滅蚴，有豐富的家畜管理和人群健教的經(jīng)驗(yàn)，但很難控制其流行傳播，這說明現(xiàn)行防治技術(shù)尚存在不足。例如，在防治中起關(guān)鍵作用的吡喹酮，不僅只能在一個(gè)用藥時(shí)點(diǎn)發(fā)揮作用，而且有研究發(fā)現(xiàn)其抗蟲效果在降低。對此，本研究認(rèn)為

2、在抗感染疫苗和抗蟲新藥尚未問世之前，深入探索提高吡喹酮生物利用度和增強(qiáng)抗蟲效果的方法是解決現(xiàn)場防治技術(shù)問題的重要課題之一。眾所周知，殺成蟲的吡喹酮和抗童蟲的青篙素類藥物用于人和家畜體內(nèi)后表現(xiàn)代謝快和分布面大的特點(diǎn)，從而使藥物的生物利用度低。如何來解決這一問題，本研究依據(jù)血吸蟲生物學(xué)特性（需通過表膜吸收和結(jié)合宿主有關(guān)分子作為生長繁殖的因子）提出了蟲體表膜有可能存在與外源分子發(fā)生特異性結(jié)合的分子，如能通過篩選獲得，就有可能用其作靶向藥物殺蟲

3、（提高藥物利用度，減少藥物所致毒副反應(yīng)）。在本文中開展研究解決的關(guān)鍵問題是從血吸蟲活蟲體表膜中能篩選和鑒定出具有特異結(jié)合能力的多肽分子，并闡明其性質(zhì)和功能，以期為進(jìn)一步的靶向藥物制劑等方面研究奠定工作基礎(chǔ)。
　　 第一章日本血吸蟲脫尾活童蟲表膜結(jié)合噬菌體短肽的篩選與鑒定
　　 目的:利用噬菌體展示肽對日本血吸蟲尾蚴脫尾活童蟲作體外差異親和淘選，以期獲得對蟲體具有拮抗或/和靶向作用的特異性短肽。
　　 方法:體外差

4、異淘選與S.j脫尾活童蟲結(jié)合、與尾蚴不結(jié)合的特異性短肽:將噬菌體12肽庫用尾蚴預(yù)吸附后，取未與尾蚴結(jié)合的噬菌體肽庫擴(kuò)增后與脫尾童蟲孵育，經(jīng)洗脫、再擴(kuò)增后，獲取的目標(biāo)肽庫再次逆向吸附——擴(kuò)增——淘選——擴(kuò)增:經(jīng)過3輪差異淘選，隨機(jī)挑取15個(gè)克隆抽提DNA測序;通過氨基酸翻譯和生物信息學(xué)分析測序結(jié)果;利用噬菌體回收實(shí)驗(yàn)、Western-blot及免疫組織化學(xué)檢測分析所得噬菌體克隆與S.j童蟲及成蟲體被結(jié)合狀態(tài)。
　　 結(jié)果:經(jīng)3輪體

5、外差異淘選獲得4種不同序列的特異性M13噬菌體短肽MppZL6、MppZL4、MppZL1和MppZL0，其中MppZL0無插入片段;經(jīng)生物信息學(xué)分析，MppZL6、MppZL4及MppZL1短肽均由8～9個(gè)親水的極性氨基酸殘基及疏水的非極性氨基酸殘基交錯(cuò)構(gòu)成，含精氨酸殘基，等電點(diǎn)分別為6.07，8.75，8.50:BLAST分析表明，MppZL1與家鼠載脂蛋白B有53％(7/13)的同一性，MppZL6與SjCHGC07116蛋白有6

6、9％(9/13)同一性，MppZL4與陰道毛滴蟲自交第三代的表面抗原BspA樣蛋白有80％(8/10)同一性。噬菌體回收實(shí)驗(yàn)顯示克隆MppZL4與脫尾童蟲的結(jié)合力顯著高于MppZL6，MppZL1;Western blot結(jié)果顯示，只有與MppZL4結(jié)合的成蟲膜蛋白中有一條特異性條帶，其大小為45.0 kDa;免疫組化染色結(jié)果表明:MppZL4可與S.j毛蚴脫尾童蟲、肺期童蟲、肝期童蟲及24天成蟲結(jié)合。
　　 結(jié)論:通過噬菌體展

7、示肽對活蟲體作體外差異親和淘選獲得的特異性M13噬菌體MppZL4，可在小鼠體內(nèi)特異性地與S.j的童蟲和成蟲表膜結(jié)合。
　　 第二章 MppZL4及人工合成短肽ZL4的功能檢測
　　 目的:通過MppZL4及人工合成的ZL4在體內(nèi)外對日本血吸蟲（S.j）的殺傷實(shí)驗(yàn)，檢測ZL4的生物學(xué)功能，并從細(xì)胞水平上初步探討ZL4的作用機(jī)制。
　　 方法:洗脫回收率檢測MppZL4對S.j的靶向性:于小鼠感染S.j3 d、及1

8、0d后，分別尾靜脈注射MppZL41012 pfu，15 min后剖殺小鼠，心臟灌注，取出肝肺，洗脫噬菌體測定豐度，設(shè)立空白對照及陰性對照組;于小鼠感染S.j24 d后，尾靜脈注射MppZL41012 pfu，15min后剖殺小鼠，心臟灌注沖蟲，并取出肝肺，洗脫噬菌體測定豐度，同時(shí)洗脫蟲體噬菌體并計(jì)數(shù)。體外殺傷實(shí)驗(yàn)檢測MppZL4對S.j脫尾童蟲的殺傷作用:無菌條件下MppZL4處理S.j脫尾童蟲，每24小時(shí)美藍(lán)染色后觀察一次，連續(xù)觀察

9、72 h，統(tǒng)計(jì)蟲體死亡率，設(shè)置陽性對照、陰性對照及空白對照組。小鼠感染S.j24 d后，尾靜脈注射MppZL41012 pfu，15 min后剖殺小鼠取出蟲體，無菌條件下制備S.j細(xì)胞，作免疫細(xì)胞化學(xué)觀察MppZL4在細(xì)胞上的定位;體外培養(yǎng)MppZL4處理的S.j細(xì)胞1d后，MTT試劑盒檢測其抑制率，并利用公式計(jì)算IC50。人工合成羅丹明標(biāo)記的ZL4短肽RhB-ZL4，同法體外檢測其對S.j童蟲的結(jié)合功能及殺傷功能，體內(nèi)檢測其對S.j成

10、蟲的結(jié)合功能。
　　 結(jié)果:洗脫回收率檢測MppZL4噬菌體靶向性結(jié)果顯示:在感染小鼠體內(nèi)，第3d時(shí)，肺組織MppZL4豐度為0.869±0.018，較高，而肝組織MppZL4豐度7.211±4.818，偏低;第10d則肺組織MppZL4豐度為0.239±0.065，較低，而肝組織MppZL4噬菌體豐度15.833±8.224，偏高;第24 d時(shí)，各組噬菌體洗脫數(shù)無明顯差異，但是蟲體MppZL4洗脫豐度17.256±9.588遠(yuǎn)

11、高于M13KE洗脫豐度0.202±0.056。體外殺傷實(shí)驗(yàn)觀察到MppZL4致死率高于東方田鼠血清陽性對照組(P=0.000);48 h后，其死亡率已達(dá)到100％。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，MppZL4主要沉積于S.j大圓細(xì)胞、三角形細(xì)胞及不規(guī)則細(xì)胞的細(xì)胞膜上。MTT檢測細(xì)胞毒效應(yīng)顯示，MppZL4濃度為1010 pfu時(shí)，即具有明顯的細(xì)胞毒性(P=0.000)，且隨著MppZL4濃度的增高，毒性效應(yīng)增強(qiáng);IC50≈1021。RhB-Z

12、L4檢測結(jié)果顯示:RhB-ZL4體外與能與脫尾童蟲體外特異性結(jié)合，其體外24hr及48hr致死率與MppZL4陽性對照組無顯著性差異，72hr后死亡率為100％;體內(nèi)能與S.j成蟲特異性結(jié)合
　　 結(jié)論:MppZL4分子對血吸蟲作用具有靶向性和一定的拮抗性及細(xì)胞毒性;RhB-ZL4可與日本血吸蟲童蟲及成蟲特異性結(jié)合，對日本血吸蟲童蟲有一定的拮抗性。
　　 第三章 ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能鑒定
　　

13、 目的:觀察日本血吸蟲表膜特異結(jié)合肽合成基因構(gòu)建的ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染Sj脫尾童蟲效率，了解其抗蟲作用。
　　 方法:構(gòu)建ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒，運(yùn)用二甲基亞砜(DMSO)作用下的高濃度質(zhì)粒浸泡技術(shù)，將ZLW/pEGFP-C2對機(jī)械轉(zhuǎn)化日本血吸蟲童蟲進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以瞬時(shí)表達(dá)的EGFP為陽性標(biāo)記，在倒置熒光鏡下對蟲體進(jìn)行觀察;轉(zhuǎn)染后童蟲培養(yǎng)48h，抽提蟲體總RNA和全蟲蛋白，分別用RT-PCR和Wester

14、n blot檢測ZLW基因和EGFP基因在童蟲體內(nèi)的表達(dá);轉(zhuǎn)染后蟲體繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48、72及96h不同時(shí)點(diǎn)用美蘭染色法鑒別蟲體死活并計(jì)數(shù);上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)空質(zhì)粒和正常童蟲作平行對照。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒，經(jīng)ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的蟲體在鏡下觀察顯示有10％的轉(zhuǎn)染率，其EGFP主要位于蟲體皮層，以口、腹吸盤最為明顯;RT-PCR擴(kuò)增出259 bp，片斷大小與預(yù)期相符，經(jīng)測序與ZLW序列一致

15、;Western-blot證實(shí)EGFP基因在童蟲蟲體內(nèi)有表達(dá)?？瓜x效果顯示，24及48h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組、對照組死亡率無明顯差異性(P24=0.600，P48=0.508);72h后，實(shí)驗(yàn)組死亡率顯著高于對照組(P72=0.000);96h后實(shí)驗(yàn)組死亡率達(dá)到100％。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒，DMSO作用下的高濃度質(zhì)粒浸泡技術(shù)成功地將ZLW/pEGFP-C2質(zhì)粒引入日本血吸蟲童蟲體內(nèi)并獲得表達(dá);ZLW/pEG