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文檔簡介
1、血吸蟲?。⊿chistosomiasis)是由血吸蟲(Schistosome)感染引起的一種分布廣泛,危害嚴重的人畜共患寄生蟲病.全球有74個國家和地區(qū)流行血吸蟲病,有5-6億人受到威脅,約2億人感染血吸蟲?。斍把x的防治策略主要以化療藥吡喹酮來進行治療,從而減少發(fā)病率.但是吡喹酮又不能避免重復感染,而且近年來曼氏血吸蟲已經(jīng)有吡喹酮抗性蟲株的報道,耐藥蟲株的出現(xiàn)引起了人們的不安與高度關(guān)注.因此,加強抗血吸蟲疫苗的開發(fā)和新藥物靶標的篩
2、選顯得格外重要.
在我國,日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)可以感染40多種哺乳動物,山羊、黃牛、綿羊、兔子和小鼠等都是其易感宿主,但是另外一些哺乳動物如大鼠等是日本血吸蟲的不易感宿主,在不易感宿主體內(nèi),血吸蟲的發(fā)育率低而且蟲體較?。畺|方田鼠是目前為止唯一一種對日本血吸蟲具有抗性的宿主,日本血吸蟲尾蚴可以感染東方田鼠,感染之后蟲體發(fā)育遲緩,在感染尾蚴15天后,東方田鼠體內(nèi)基本上找不到存活的蟲體,感染4
3、2天后,東方田鼠體內(nèi)檢查不到日本血吸蟲成蟲,不同的宿主能夠為日本血吸蟲提供不同的生存環(huán)境,影響到蟲體的生存和發(fā)育,不同宿主環(huán)境中生長的蟲體在蛋白表達上也會存在差異,而這些差異表達的蛋白可能是蟲體生存發(fā)育所需要的關(guān)鍵分子.因此找到在不同易感性宿主環(huán)境中日本血吸蟲生長發(fā)育差異的蛋白具有重要理論和實際意義.
1、日本血吸蟲童蟲在不同敏感性宿主體內(nèi)差異表達蛋白的研究
本文應(yīng)用熒光差異凝膠雙向電泳技術(shù)(2D-DIGE)
4、,對BALB/c小鼠、Wistar大鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d日本血吸蟲童蟲的蛋白表達情況進行了分析,通過DoCyder6.5軟件分析和匹配后,得到了1721個點適合進行后續(xù)的差異分析.在大鼠體內(nèi)lOd童蟲蛋白和小鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白的比較分析中發(fā)現(xiàn),有39個蛋白點存在顯著性差異,其中有27個蛋白點在小鼠體內(nèi)10d童蟲中高表達,12個蛋白點低表達.在小鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白和東方田鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白的比較分析中發(fā)現(xiàn),有21個蛋白點存在顯著
5、性差異,其中有13個蛋白點在小鼠體內(nèi)10d童蟲中高表達,8個蛋白點低表達.
將分析膠與制備膠進行比對挑點,最終共有44個差異表達蛋白能夠進行后續(xù)的質(zhì)譜分析,將質(zhì)譜鑒定出的數(shù)據(jù)進行搜庫比對,其中3個蛋白點沒有注釋信息,其余41個蛋白點經(jīng)過序列比對與去重復分析后發(fā)現(xiàn),共代表了33種蛋白.
為了驗證2D-DIGE實驗分析的可靠性,我們挑取了其中6個差異表達蛋白進行了實時定量分析,在基因水平上對其結(jié)果進行驗證,驗證結(jié)
6、果顯示,實時定量的結(jié)果與2D-DIGE的結(jié)果基本一致.
我們對差異表達蛋白進行了GO分類以及KEGG通路分析,結(jié)果顯示,在小鼠體內(nèi)10d童蟲和大鼠體內(nèi)10d童蟲的差異表達蛋白中,40%的差異蛋白在蛋白代謝途徑中,26%的差異蛋白在糖類代謝途徑中,13%的差異蛋白在RNA代謝途徑中,9%的差異蛋白與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),其余的差異表達蛋白與蛋白轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)基因表達和細胞骨架蛋白有關(guān)。在小鼠體內(nèi)10d童蟲和東方田鼠體內(nèi)10d童蟲的差異表
7、達蛋白中,53%的差異蛋白在蛋白代謝途徑中,23%的差異蛋白在RNA代謝途徑中,其余的差異表達蛋白與糖類代謝途徑、核酸代謝途徑和細胞骨架蛋白有關(guān)。其中線粒體外膜轉(zhuǎn)移酶復合物TOM34、蛋白酶體亞基、核內(nèi)核糖體異構(gòu)蛋白K和肌動蛋白在易感宿主小鼠體內(nèi)高表達,而半胱氨酸蛋白酶抑制劑、醛縮酶和70kDa熱激蛋白在不易感宿主大鼠體內(nèi)或抗性宿主東方田鼠體內(nèi)高表達.
本文首次對不同宿主體內(nèi)的日本血吸蟲10d童蟲進行了蛋白質(zhì)組分析,為我們
8、更好的理解血吸蟲的生長發(fā)育機制提供了依據(jù),同時也可為抗血吸蟲疫苗和潛在藥物靶標的研究提供基礎(chǔ).
2、日本血吸蟲蛋白酶體a5和a2亞基基因的克隆、表達及免疫效果觀察
本文利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲18 d童蟲中首次擴增到蛋白酶體a5亞基基因(GcnBank accession FJ595238).序列分析表明蛋白酶體a5亞基基因的ORF含747bp,編碼248個氨基酸,理論分子量27.38 kDa.同源性
9、分析結(jié)果顯示,該基因分別為日本血吸蟲蛋白酶體a5亞基,命名為SjPSMA5.實時定量PCR對該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達情況進行了分析,結(jié)果顯示,該基因在7d、13d、18d、23 d、32 d和42 d蟲體中都有表達,13d和32 d蟲體中的表達量高于其他時期;在小鼠體內(nèi)的lOd童蟲中的表達量要高于大鼠和東方田鼠體內(nèi)的lOd童蟲中的表達量.構(gòu)建了該基因的原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA5,在大腸
10、桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達,重組蛋白rSjPSMA5以包涵體形式存在.Western印跡顯示表達的重組蛋白rSjPSMA5能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識別,并且能檢測到天然狀態(tài)下該蛋白的存在.免疫組化實驗結(jié)果表明,SjPSMA5蛋白在蟲體各組織器官內(nèi)廣泛分布.應(yīng)用重組蛋白免疫BALB/c小鼠后,產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平,并且CD4+細胞數(shù)量顯著升高,誘導了23.29%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率,
本文利用RT
11、-PCR技術(shù)從日本血吸蟲18 d童蟲中擴增到蛋白酶體0.2亞基基因(GenBank accession AY813725).序列分析表明蛋白酶體a2亞基基因的ORF含708bp,編碼235個氨基酸,理論分子量25.84 kDa.同源性分析結(jié)果顯示,該基因為日本血吸蟲蛋白酶體a2亞基,命名為SjPSMA2。實時定量PCR對該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達情況進行了分析,結(jié)果顯示,該基因在7d、13d、18d、23
12、d、32 d和42 d蟲體中都有表達,7d和23d蟲體表達量低于其他幾個時期;在小鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達量要略高于大鼠和東方田鼠體內(nèi)的lOd童蟲中的表達量.構(gòu)建了該基因的原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達,重組蛋白rSjPSMA2以包涵體形式存在.Western印跡顯示表達的重組蛋白rSjPSMA2能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識別,并且能檢測到天然狀態(tài)下該蛋白的存在.免疫組化實驗結(jié)果
13、表明,SjPSMA2蛋白在蟲體各組織器官內(nèi)廣泛分布,應(yīng)用該重組蛋白免疫BALB/c小鼠后,產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平,誘導了12.33%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率.
綜上所述,SjPSMA5和SjPSMA2都可作為潛在的抗血吸蟲病的疫苗候選分子,SjPSMA5和SjPSMA2基因及表達產(chǎn)物的獲得,為探索蛋白酶體在血吸蟲生長發(fā)育中的作用提供了重要基礎(chǔ).
3、日本血吸蟲硫氧還蛋白過氧化物酶的特性研究
14、> 根據(jù)GenBank上公布的日本血吸蟲硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxinperoxidse,TPx)基因的登陸號AY813893,對其序列進行分析,結(jié)果表明,該基因的ORF含681bp,編碼227個氨基酸,理論分子量25.09 kDa.信號肽預(yù)測顯示,該基因的前24個氨基酸為信號肽序列.設(shè)計去除信號肽序列的引物,利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲42 d童蟲中擴增到約600bp的產(chǎn)物.測序結(jié)果表明,擴增片斷為日本血吸蟲硫
15、氧還蛋白過氧化物酶去除信號肽后的ORF序列.實時定量PCR對該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達情況進行了分析,結(jié)果顯示,該基因在蟲卵、尾蚴、7d、13d、21d、28 d、35 d和42 d蟲體中都有表達,7d、13d和42 d雌蟲中表達量高于其他幾個時期;在大鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達量要高于小鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達量.構(gòu)建了該基因的原核表達質(zhì)粒pET2Sa(+)-SjTPx,在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲
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