日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白的篩選、鑒定及重組表達(dá).pdf

1、日本血吸蟲(chóng)病是由日本血吸蟲(chóng)感染所引起的人獸共患病，是我國(guó)的重點(diǎn)防治的傳染性疾病之一，主要流行于長(zhǎng)江流域以南的12個(gè)省、市、自治區(qū)，其中湖南、湖北、安徽、江西、江蘇、四川及云南等7個(gè)省的疫情仍未得到完全的控制。我國(guó)的日本血吸蟲(chóng)病的防治足以綜合防治為豐，結(jié)合吡喹酮藥物治療，但由于重復(fù)感染現(xiàn)象普遍，長(zhǎng)期的應(yīng)用可能產(chǎn)生耐藥性，因此尋找新的藥物作用靶標(biāo)和疫苗是日本血吸蟲(chóng)病的研究重點(diǎn)之一。酶(enzyme)是由生物體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑，大部

2、分為蛋白質(zhì)少數(shù)為RNA組成，在十分溫和的條件下，高效率地催化機(jī)體中各種牛物化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)生物體的新陳代謝。因此，尋找日本血吸蟲(chóng)特異性酶類分子將為抗血吸蟲(chóng)病新藥的篩選及疫苗的研制提供研究基礎(chǔ)。 研究目的 建立本地化的日本血吸蟲(chóng)酶蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)篩選、識(shí)別和實(shí)驗(yàn)分析，為日本血吸蟲(chóng)病疫苗研究及新藥開(kāi)發(fā)提供新的候選分子。 研究方法 1.日本血吸蟲(chóng)酶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的建立利用公共蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)采集日本血吸蟲(chóng)蛋

3、白序列所含有的信息，從日本血吸蟲(chóng)蛋白序列中篩選出所有的日本血吸蟲(chóng)酶蛋白序列。根據(jù)蛋白的酶促性質(zhì)以及GO分類方法對(duì)其分類，并將其gi號(hào)與分類進(jìn)行關(guān)聯(lián)，從而建立本地的日本血吸蟲(chóng)酶蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。 2.日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白的篩選與鑒定將日本血吸蟲(chóng)酶蛋白序列與本地的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果的特征，采用了相似性和E值兩個(gè)指標(biāo)對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選，獲得了6個(gè)可能的日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白序列，并采用RT-PCR和生

4、物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定和分析。 3.日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白GST10的生物信息學(xué)分析GST10是從特異性酶蛋白中篩選出來(lái)的一種新的酶蛋白，對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)、抗原表位、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，直系及并系同源性進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。 4.GST10基因表達(dá)水平的研究利用半定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)篩選出的GST10在日本血吸蟲(chóng)的成蟲(chóng)、蟲(chóng)卵、尾蚴期的基因表達(dá)水平做相對(duì)定量分析。同時(shí)制備多個(gè)單條成蟲(chóng)的

5、cDNA，以此為模板對(duì)GST10及其同家族的日本血吸蟲(chóng)酶蛋白在不同蟲(chóng)體的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。 5.GST10的重組表達(dá)及免疫學(xué)分析構(gòu)建GST10重組蛋白原核表達(dá)體系，對(duì)表達(dá)的重組融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)后，過(guò)層析柱純化。收集重組蛋白的免疫鼠血清及自然情況下日本血吸蟲(chóng)感染人血清，利用Western-blot方法對(duì)重組融合蛋白的免疫原性與免疫反應(yīng)性進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 1.共獲得日本血吸蟲(chóng)酶蛋白序列2302

6、條，并按照其信息采集的方式不同分為已知日本血吸蟲(chóng)酶蛋白序列162條和未知日本血吸蟲(chóng)酶蛋白序列2140條，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了完善的日本血吸蟲(chóng)酶蛋白分類系統(tǒng)，建立了本地日本血吸蟲(chóng)酶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。 2.確立了特異性日本血吸蟲(chóng)酶蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，與本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后經(jīng)篩選得到了6條日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白。 3.采用RT-PCR方法對(duì)日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白進(jìn)行了鑒定，同時(shí)按照疫苗候選分子所應(yīng)具有的特性從日本血吸蟲(chóng)特異性酶蛋白中篩選

7、出了擁有GST_C家族結(jié)構(gòu)域的特異性酶蛋白，并將其命名為GST10。 4.對(duì)GST10的基因表達(dá)水平的研究提示該蛋白在成蟲(chóng)、尾蚴的表達(dá)水平接近，明顯高于在蟲(chóng)卵的表達(dá)水平。以單個(gè)體的成蟲(chóng)eDNA為模板的RT-PCR結(jié)果提示GST10在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)中呈現(xiàn)高水平的表達(dá)，且該蛋白與同家族酶蛋白GST28和GST26在催化活性上存在一定的協(xié)同作用。 5.通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)得到了純化的重組融合蛋白(re-GST10)，經(jīng)Wester

8、n-blot驗(yàn)證，re-GST10可以被自然情況下日本血吸蟲(chóng)感染人血清、重組的GST26免疫鼠血清及帶6個(gè)His標(biāo)簽的重組GST10免疫鼠血清所識(shí)別，顯示出該融合蛋白具有很好的免疫反應(yīng)性。 結(jié)論 我們對(duì)2302個(gè)日本血吸蟲(chóng)酶蛋白進(jìn)行了篩選，從中獲得了6個(gè)特異性高的酶蛋白。對(duì)6個(gè)特異性酶蛋白的編碼基因進(jìn)行了鑒定和初步的分析后從中獲得了一種具有GST_C家族結(jié)構(gòu)域的酶蛋白，根據(jù)其分子量被命名為GST10。該蛋白在日本血吸蟲(chóng)的