Cajal間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及胃動(dòng)素受體的表達(dá).pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景：
　　ICC是廣泛分布于胃腸道平滑肌和神經(jīng)叢的一類(lèi)特殊類(lèi)型間質(zhì)細(xì)胞。研究證實(shí)其主要功能有[1,2]：1、胃腸道慢波活動(dòng)的起搏細(xì)胞；2、促進(jìn)電活動(dòng)的傳導(dǎo)；3、介導(dǎo)胃腸神經(jīng)和平滑肌之間信號(hào)傳導(dǎo)；4、作為牽張感受器協(xié)調(diào)機(jī)械壓力的輸入。
　　許多胃腸動(dòng)力障礙性疾病與ICC的異常變化有關(guān)。因此，在胃腸道把ICC作為治療和研究的靶目標(biāo)很有現(xiàn)實(shí)意義。但是體外分離和培養(yǎng)ICC仍存在許多不確定因素，尤其是長(zhǎng)期培養(yǎng)ICC的可行性及IC

2、C的生物學(xué)特性等問(wèn)題仍然不能解釋清楚。有關(guān)ICC的培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇也未見(jiàn)報(bào)道，因此摸索ICC長(zhǎng)期培養(yǎng)的條件，了解細(xì)胞生物學(xué)特性，為持續(xù)性研究ICC功能打下基礎(chǔ)。
　　近來(lái)研究顯示在ICC上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十余種類(lèi)型的受體,包括：膽囊收縮素受體A[3]、G蛋白偶聯(lián)受體（PKA,PKC）[4]、膽堿能（M2,M3）受體[5]、神經(jīng)激肽（NK1,NK3）受體[6]、嘌呤能（P2Y1,P2Y4,P2X2,P2X5）受體[7,8]、五羥色胺

3、(5-HT,5-HT3,5-HT4)受體[9,10]等。受體的研究對(duì)詮釋細(xì)胞功能及新型藥物研發(fā)有重要的指導(dǎo)意義。
　　胃動(dòng)素是由22個(gè)氨基酸組成的單鏈腦腸肽，主要由十二指腸和空腸黏膜上皮Mo內(nèi)分泌細(xì)胞分泌。其生理作用是來(lái)調(diào)節(jié)胃腸移行性運(yùn)動(dòng)復(fù)合波(MMC)。而胃動(dòng)素調(diào)節(jié)胃腸活動(dòng)的機(jī)制一個(gè)重要突破口就是胃動(dòng)素受體的分布及受體后信號(hào)通路的研究。根據(jù)目前報(bào)道胃動(dòng)素受體在不同物種的胃腸平滑肌細(xì)胞和腸神經(jīng)元均有表達(dá)[11,12,13,14,1

4、5,16,17,18]。而作為胃腸功能單位“神經(jīng)-ICC-平滑肌”網(wǎng)絡(luò)中ICC是否會(huì)存在胃動(dòng)素受體表達(dá)？我們先前的關(guān)于ICC在胃動(dòng)素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)平滑肌收縮中作用機(jī)制的研究顯示ICC可能存在胃動(dòng)素受體表達(dá)[19]。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　本研究目的就是探討ICC的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇、傳代的條件，了解細(xì)胞的生物學(xué)特性；分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、基因和蛋白水平來(lái)驗(yàn)證ICC上是否存在胃動(dòng)素受體的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分

5、：以兔小腸為ICC組織來(lái)源，應(yīng)用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)ICC；特異的c-kit抗體對(duì)ICC進(jìn)行免疫熒光鑒定；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；摸索細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的條件；用MTT法測(cè)定傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　第二部分：新鮮分離的細(xì)胞和培養(yǎng)15天的細(xì)胞分別進(jìn)行流式細(xì)胞分析c-kit陽(yáng)性細(xì)胞比率，選用陽(yáng)性率高的方法進(jìn)行ICC的分選；以流式細(xì)胞儀分選的ICC為靶細(xì)胞，分別采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Westernblot）

6、技術(shù)。將提取的細(xì)胞總RNA和總蛋白，進(jìn)行分析檢測(cè)；應(yīng)用特異性c-kit蛋白抗體、胃動(dòng)素受體抗體(anti-GPR38)以及細(xì)胞核染料（hoechst33342）對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色；從基因和蛋白水平以及細(xì)胞形態(tài)方面來(lái)驗(yàn)證ICC是否表達(dá)胃動(dòng)素受體。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、普通光鏡和免疫熒光分析證實(shí)成功分離、培養(yǎng)ICC；細(xì)胞傳代達(dá)數(shù)次，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ICC經(jīng)凍存后復(fù)蘇成功；成功繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

7、　　2、比較新鮮分離的細(xì)胞和培養(yǎng)數(shù)日的細(xì)胞流式分析結(jié)果，c-kit陽(yáng)性細(xì)胞比率。前者為9.8％，后者為19.1％。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)流式分析的陽(yáng)性細(xì)胞比率高；選用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行流式分選作為細(xì)胞來(lái)源。再次流式分析培養(yǎng)的細(xì)胞中c-kit陽(yáng)性細(xì)胞比率為64.3％，分選出陽(yáng)性細(xì)胞分別為6.7×105個(gè)和5.6×106個(gè)；分別對(duì)提取ICC的總RNA和總蛋白分析檢測(cè)顯示胃動(dòng)素受體mRNA以及受體蛋白定性分析結(jié)果均為陽(yáng)性；細(xì)胞免疫熒光三標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示ICC胞膜