肛門直腸畸形泄殖腔凋亡及腸管Cajal間質(zhì)細胞的研究.pdf

1、本文擬通過乙烯硫脲致畸動物模型研究胚胎末期ARM整個腸管ICC的發(fā)育情況并進一步利用ARM患者直腸末端標本來研究直腸末端ICC的表達情況，為ARM術(shù)后便秘的診斷、治療提供一些理論依據(jù)。 研究方法： 1、利用TUNEL染色技術(shù)檢測正常胎鼠、泄殖腔畸形胎鼠胚胎13天-16天泄殖腔凋亡細胞的動態(tài)分布情況。 2、利用SABC染色方法研究正常胎鼠、泄殖腔畸形胎鼠胚胎13天-16天泄殖腔bcl-2，bax基因的表達情況。

2、 3、利用SABC染色方法檢測胚胎21天正常胎鼠、ARM胎鼠小腸、結(jié)腸和直腸ICC的發(fā)育情況。 4、利用RT-PCR方法研究28例ARM患者直腸末端c-kit基因和SCF基因的表達情況。 研究結(jié)果： 1、肛門直腸畸形泄殖腔凋亡細胞的動態(tài)分布情況： 正常胎鼠胚胎13天生殖結(jié)節(jié)已形成，泄殖腔的輪廓清晰，在泌尿生殖竇和直腸間可見尿直腸隔，尾溝已形成。尿直腸隔上皮層和間質(zhì)區(qū)域可見凋亡細胞。隨著胚胎發(fā)育，生殖結(jié)

3、節(jié)逐漸向腹尾側(cè)延伸，尿直腸隔逐漸向下延伸并向腹尾側(cè)遷移，尾溝逐漸加深，泄殖腔膜向背尾側(cè)旋轉(zhuǎn)。尿直腸隔間質(zhì)的凋亡細胞逐漸增多并向下延伸，腹側(cè)間質(zhì)比背側(cè)間質(zhì)凋亡細胞明顯；直腸背側(cè)間質(zhì)可見大量凋亡細胞。胚胎14天，直腸末端和未來肛門開口處的泄殖腔膜開始出現(xiàn)凋亡細胞，此期為細胞凋亡發(fā)揮作用的關(guān)鍵時期。胚胎15天，尿直腸隔與泄殖腔膜融合，尿直腸隔間質(zhì)內(nèi)的凋亡細胞一直向下延伸到融合部位。胚胎16天，肛膜裂解，直腸與外界相通。 泄殖腔發(fā)育畸形

4、胎鼠與正常胎鼠相比，生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育、尿直腸隔的下降和泄殖腔構(gòu)型的變化均不同程度的延遲。尿直腸隔間質(zhì)、直腸背側(cè)間質(zhì)和泄殖腔膜的凋亡細胞均明顯減少。胚胎15天，尿直腸隔未與泄殖腔膜融合，直腸末端與泄殖腔膜的距離仍較遠。胚胎16天，肛膜未裂解，產(chǎn)生不同類型的ARM畸形。 2、肛門直腸畸形泄殖腔bcl-2，baX基因的表達情況： 正常胎鼠胚胎13天尿直腸隔上皮層bax抗體染色陽性細胞占細胞總數(shù)的80％以上；尿直腸隔間質(zhì)染色陽性細

5、胞很少，不超過總數(shù)的10％。隨著胚胎發(fā)育，上皮層陽性細胞逐漸減少；而間質(zhì)，胚胎14天陽性細胞明顯增多，在未來肛門開口的泄殖腔膜上皮層可見陽性細胞。胚胎15、16天間質(zhì)內(nèi)的陽性細胞較少。與正常胎鼠相比，泄殖腔畸形胎鼠胚胎13.5天、14天上皮層和間質(zhì)區(qū)域bax抗體陽性細胞明顯減少。 正常胎鼠bcl-2抗體染色陽性細胞在尿直腸隔上皮層胚胎13天最明顯，后逐漸減少。而在尿直腸隔間質(zhì)區(qū)域陽性細胞不超過10％，各期無明顯變化。與正常胎鼠相

6、比，泄殖腔畸形胎鼠胚胎13.5天尿直腸隔上皮層和間質(zhì)區(qū)域bcl-2抗體陽性細胞比例明顯增加。 3、肛門直腸畸形腸管Cajal間質(zhì)細胞的表達情況： 小腸、結(jié)腸和直腸c-kit抗體陽性細胞主要分布于肌間神經(jīng)叢，肌間可見少量陽性細胞。 正常胎鼠，胚胎21天小腸、結(jié)腸和直腸80％以上的肌間神經(jīng)叢周圍可見大量c-kit抗體陽性細胞；ARM畸形胎鼠除小腸80％以上肌間神經(jīng)叢周圍有大量陽性細胞外，結(jié)腸和直腸陽性細胞明顯減少，僅

7、50％或50％以下的肌間神經(jīng)叢周圍有陽性細胞。 4、肛門直腸畸形直腸末端c-kit和SCF的表達情況： c-kit mRNA的表達在正常對照組、高位ARM組、中位．ARM組、低位ARM組、后天性肛瘺組分別為1.79±0.22、0.67±0.19、0.89±0.17、1.57±0.25、1.68±0.18。與正常對照組相比較，高位ARM組、中位ARM組有意義(P<0.05)；后天性肛瘺組、低位ARM組無意義(P>0.05)

8、。 SCF mRNA的表達在正常對照組、高位ARM組、中位ARM組、低位ARM組、后天性肛瘺組分別為1.72±0.19、0.65+0.16、0.98+0.19、1.61±0.24、1.69±0.14。與正常對照組相比較，高位、中位ARM組有意義(P<0.05)；后天性肛瘺組、低位ARM組無意義(P>0.05)。 研究結(jié)論： 1、在肛門直腸的胚胎發(fā)育過程中，尿直腸隔的下降、融合過程、泄殖腔的構(gòu)型變化和肛膜的裂解均與

9、細胞凋亡密切相關(guān)。泄殖腔畸形胎鼠尿直腸隔間質(zhì)、直腸背側(cè)間質(zhì)和泄殖腔膜的凋亡細胞明顯減少，阻礙了泄殖腔的正常胚胎發(fā)育過程，可能是導致ARM產(chǎn)生的重要機制之一。 2、在泄殖腔發(fā)育過程中，尿直腸隔上皮細胞、間質(zhì)細胞表達bcl-2、bax基因。并且這兩種基因相互作用共同調(diào)節(jié)泄殖腔細胞的凋亡，保證泄殖腔的正常發(fā)育。而肛門直腸畸形胎鼠尿直腸隔上皮細胞、間質(zhì)細胞bcl-2、bax基因表達異常，導致泄殖腔細胞凋亡的異常，是產(chǎn)生ARM畸形的原因之