肛門直腸畸形大鼠盆底肌異常發(fā)育機(jī)制及子宮內(nèi)移植肌衛(wèi)星細(xì)胞修復(fù)作用的研究.pdf

1、目的：先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations，ARMs)是小兒外科常見的先天畸形之一，居消化道畸形第一位，在新生兒的發(fā)病率為1/5000～1/1500。雖然近年來對肛門直腸畸形的治療方式有了很大的改善，術(shù)后監(jiān)護(hù)也取得了很大水平進(jìn)步，這使得患者整體預(yù)后得到了顯著改善，但是通過對ARMs患者長時(shí)間的隨訪發(fā)現(xiàn)，很多ARMs患者在手術(shù)后仍然存在便秘、便失禁等肛腸功能障礙相關(guān)的并發(fā)癥，對患者的日常生活帶來很多不便，對他

2、們的生理、心理健康造成了非常嚴(yán)重的影響?；颊咝g(shù)后仍然存在肛腸功能障礙是由多種因素導(dǎo)致的，如盆底肌發(fā)育障礙、支配盆底肌的神經(jīng)分布出現(xiàn)異常、腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良和骶尾椎發(fā)育不良等。其中，盆底橫紋肌復(fù)合體(Striated Muscle Complex，SMC)是控制排便功能的關(guān)鍵因素之一，所以SMC發(fā)育異常是影響ARMs術(shù)后患者排便功能最重要的原因之一。正常胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)異?；虬l(fā)育障礙導(dǎo)致了患者發(fā)生肛門直腸畸形。引起患者在胚胎期肛門直腸

3、發(fā)育障礙的具體原因尚不清楚，目前，很多學(xué)者認(rèn)為肛門直腸畸形的發(fā)生很大程度上受到遺傳因素的影響。研究已經(jīng)證實(shí)，在肛門直腸畸形患者中，肛門直腸存在畸形的同時(shí)多伴隨發(fā)生不同程度的橫紋肌復(fù)合體發(fā)育異常。雖然為了闡明肛門直腸畸形橫紋肌復(fù)合體異常發(fā)育的機(jī)制，人們進(jìn)行了大量的研究，但是，迄今為止，其胚胎異常發(fā)育機(jī)制尚不清楚。前期的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:SMC胚胎發(fā)育的時(shí)期是E16-E21，與正常組相比，ARMs組的SMC在E16、E17時(shí)在形態(tài)與走形上沒

4、有明顯差異，但是從E18開始，SMC開始向頭側(cè)、腹側(cè)及中線方向移位，即向直腸盲端下方聚集，并會(huì)合于直腸盲袋后下方的中線上，呈現(xiàn)倒“V”字結(jié)構(gòu)。在高倍鏡下可見肌纖維走行紊亂，在肌束間可以觀察到有大量結(jié)締組織浸潤。凋亡在正常SMC的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用，異常凋亡可能是引起肛門直腸畸形大鼠SMC發(fā)育異常的原因之一。此外，ARMs大鼠SMC存在肌衛(wèi)星細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的異常，這也可能導(dǎo)致SMC發(fā)育不良。也有研究顯示，與同一時(shí)間點(diǎn)的正常

5、組相比，Wnt5a在ARMs組SMC表達(dá)下調(diào)，這種表達(dá)的不平衡性表明Wnt5a在肛門直腸畸形胎鼠盆底SMC的異常發(fā)育過程中發(fā)揮了非常重要的作用。干細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)異常是先天畸形發(fā)生的原因之一，而這種調(diào)節(jié)異常往往是因?yàn)楸碛^遺傳和基因改變造成的。研究已經(jīng)證實(shí)，Wnt信號(hào)通路與其他的分子信號(hào)通路在作用上有相互交叉，包括Shh，BMP/TGF-β，F(xiàn)gf和Notch，這些共同構(gòu)成了干細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。BMPs是TGF-β超家族的亞群，在肌衛(wèi)星細(xì)胞的

6、激活和增殖過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并且能夠阻止過早的肌源性分化。BMPs通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合從而啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，而且形成由兩個(gè)二聚體（Ⅰ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體）組成的異四聚體復(fù)合物。此外，研究發(fā)現(xiàn)，刺激BMP信號(hào)通路可導(dǎo)致處于激活狀態(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量增加，以及處于分化狀態(tài)的成肌細(xì)胞數(shù)量減少。而且，研究表明，BMP4、BMP7在胚胎后腸的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，BMP4、BMP7在后腸的表達(dá)下調(diào)，可能

7、導(dǎo)致了ARMs后腸的異常發(fā)育。然而，BMP4、BMP7在ARMs異常發(fā)育的SMC中的作用尚不清楚。當(dāng)前針對肛門直腸畸形術(shù)后患兒仍然存在肛腸功能障礙的問題，提出了許多治療措施來加強(qiáng)盆底肌的功能，以期得到更好的排便控制，諸如生物反饋訓(xùn)練、電刺激括約肌與骶神經(jīng)以及內(nèi)外括約肌成形術(shù)等的這些措施主要通過重新建立神經(jīng)反射弧以及改變直腸肛管角度等方面以使患者得到更好的排便控制，盡管這些措施從一定程度上改善了ARMs術(shù)后患者的肛腸功能障礙的癥狀，但是隨

8、訪發(fā)現(xiàn)這些措施的遠(yuǎn)期效果并不是十分理想，因?yàn)檫@些措施并沒有從根本上解決控制排便的盆底橫紋肌復(fù)合體存在異常發(fā)育的問題。目前，針對ARMs患者存在的發(fā)育不良的SMC這一問題，臨床上通常將股薄肌、臀大肌等肌肉移植到發(fā)育不良的SMC區(qū)域來部分代償SMC的功能，但是因?yàn)榭刂婆疟愕呐璧准〉募±w維是耐疲勞的Ⅰ型肌纖維，而這些肌肉的肌纖維是易疲勞的Ⅱ型肌纖維，而且支配這些肌肉與盆底肌肌纖維的神經(jīng)分布不同，排便反射的反射弧無法正常建立，難以達(dá)到理想的遠(yuǎn)期

9、效果。細(xì)胞移植作為修復(fù)損傷和改善預(yù)后的一種新的治療思路，現(xiàn)在越來越受到人們的普遍關(guān)注。肌衛(wèi)星細(xì)胞在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，定植于骨骼肌纖維基底膜下，當(dāng)骨骼肌組織受到病理刺激或者損傷后，位于基底膜下的衛(wèi)星細(xì)胞迅速活化，增殖以及融合，從而便于處于病理狀態(tài)的肌纖維發(fā)生迅速修復(fù)和再生。本文應(yīng)用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)對Wistar大鼠進(jìn)行致畸，建立肛門直腸畸形動(dòng)物模型，探索正常胎鼠及ARMs胎鼠在盆底SMC胚胎發(fā)育過

10、程中差異表達(dá)的基因，以及BMP4、BMP7時(shí)空表達(dá)存在的差異，同時(shí)通過提取骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖，攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒轉(zhuǎn)染后移植入ARMs胎鼠發(fā)育異常的SMC區(qū)域，并在移植后觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞在體內(nèi)存活、分化情況，探索肌衛(wèi)星細(xì)胞移植治療ARMs發(fā)育不良SMC的可行性。
　　方法：⑴動(dòng)物模型制各及標(biāo)本收集。Wistar大鼠，體重250～300 g，10～12周齡，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄鼠以5∶1比例

11、交配，次日清晨陰道涂片，置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)載玻片上有精子者則定為孕0天(E0)，于E10經(jīng)胃管注入1％ ETU(125 mg/kg)致畸，制作ARMs大鼠動(dòng)物模型，對照組給予等量的生理鹽水。選擇E17、E19、E21三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用10％水合氯醛（3.2 ml/kg）腹腔注射麻醉孕鼠，然后剖宮取胎，一部分標(biāo)本取其盆底部放于4％多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常溫保存，用于切片進(jìn)行免疫組化染色;另一部分標(biāo)本在

12、解剖顯微鏡下取盆底SMC組織，深度冰箱凍存，用于Western Blotting及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。⑵應(yīng)用Agilent全基因表達(dá)譜芯片對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩查。在E17、E21取正常組及ARMs組SMC組織，進(jìn)行“Agilent全基因表達(dá)譜芯片”實(shí)驗(yàn)（上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供）。篩查正常組和ARMs組中可能存在的差異表達(dá)的基因，以及參與其中的信號(hào)通路;并運(yùn)用qRT-PCR對其中與后腸發(fā)育和骨骼肌發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。⑶BMP4及

13、BMP7在兩組大鼠胚胎SMC發(fā)育過程中表達(dá)的研究。應(yīng)用免疫組化方法觀察BMP4及BMP7蛋白在大鼠胚胎晚期SMC發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)模式;應(yīng)用Western Blotting的方法對BMP4及BMP7蛋白進(jìn)行定量分析;運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對在正常組和ARMs組大鼠胚胎發(fā)育過程中盆底肌中BMP4及BMP7的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，初步探索兩種基因在SMC發(fā)育過程中可能起到的作用。⑷子宮內(nèi)肌衛(wèi)星細(xì)胞移植修復(fù)盆底橫紋肌復(fù)合體。應(yīng)用兩步

14、消化法從出生3天內(nèi)新生雄鼠后肢提取肌衛(wèi)星細(xì)胞，并利用差速貼壁法進(jìn)行純化，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖，應(yīng)用免疫熒光染色法對肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行鑒定，肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-eGFP)轉(zhuǎn)染后，移植入ARMs胎鼠的SMC區(qū)域，觀察移植后肌衛(wèi)星細(xì)胞在ARMs胎鼠體內(nèi)SMC區(qū)域存活及分化情況，初步探索子宮內(nèi)移植肌衛(wèi)星細(xì)胞治療ARMs胎鼠發(fā)育不良的SMC的可行性。⑸統(tǒng)計(jì)分析。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件

15、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各胎齡正常組與ARMs組差異的比較采用t檢驗(yàn)，移植后胎鼠存活率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①全基因表達(dá)譜芯片篩查(篩查條件為:Fold Change cut-off:2.0，P-value cut-off:0.05)結(jié)果顯示:ARMs組較Normal組E17下調(diào)基因296個(gè)，上調(diào)基因180個(gè)，E21下調(diào)基因250個(gè)，上調(diào)基因230個(gè)。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對其中與后腸發(fā)育和骨骼

16、肌發(fā)育相關(guān)的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示qRT-PCR的結(jié)果與表達(dá)譜芯片的結(jié)果趨勢基本一致。②對BMP4蛋白及mRNA的定性及定量研究發(fā)現(xiàn)，ARMs胎鼠SMC中BMP4表達(dá)明顯減弱。正常組中，從E17到E21，隨著胚胎的發(fā)育，BMP4表達(dá)逐漸增強(qiáng)。而在ARMs組中，同一時(shí)間點(diǎn)BMP4的表達(dá)明顯較正常組減弱，并且隨時(shí)間推移這種差異表達(dá)越明顯。③通過對比研究BMP7蛋白及mRNA在兩組胚胎SMC組織中的時(shí)空表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在正常組中，BMP7蛋白在

17、E17時(shí)在SMC中有表達(dá)，在E19時(shí)BMP7表達(dá)強(qiáng)度明顯升高，在SMC及球海綿體肌中均可以看到BMP7標(biāo)記的陽性細(xì)胞，在E21時(shí)BMP7表達(dá)降低，表達(dá)位置沒有變化。而在ARMs組，與正常組同時(shí)間點(diǎn)相比，BMP7表達(dá)明顯減弱，但是表達(dá)趨勢與正常組一致。④提取的肌衛(wèi)星細(xì)胞在體外培養(yǎng)后48h后Desmin染色陽性，體外培養(yǎng)72h后Myosin染色陽性。肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)Ad-eGFP轉(zhuǎn)染后移植到ARMs胎鼠SMC區(qū)域，移植后肌衛(wèi)星細(xì)胞在ARMs胎鼠

18、體內(nèi)存活，并表達(dá)骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白Desmin以及成熟骨骼肌細(xì)胞特異性標(biāo)記Myosin。
　　結(jié)論：⑴大鼠盆底橫紋肌復(fù)合體的胚胎期發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。全基因表達(dá)譜芯片篩查結(jié)果提示正常組和ARMs組中差異表達(dá)的基因較多，并且有較多信號(hào)傳導(dǎo)通路參與，這些差異表達(dá)的基因及所在的信號(hào)傳導(dǎo)通路可能是導(dǎo)致ARMs胎鼠SMC異常發(fā)育的原因。⑵E17-E21，BMP4和BMP7在ARMs組SMC中的表達(dá)較正常組弱，BMP4和BMP7的低表達(dá)