植物細胞培養(yǎng)

1、,第二章 植物組織與細胞培養(yǎng),2.1 植物組織與細胞培養(yǎng)區(qū)別組織培養(yǎng)概念：指從機體內(nèi)取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外進行培養(yǎng)，使之生存或生長成組織。細胞培養(yǎng)概念：植物細胞在體外條件下的存活或生長，此時細胞不再形成組織。,,,2.2 植物組織的發(fā)展簡史,①探索階段（本世紀初~30年代中） 1902年，德國植物生理學家Haberlanclt首次進行了細胞培養(yǎng)實驗 ②奠基階段（30~50年代） 1934年，

2、White 等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一個活躍生長的無性繁殖系。 1943年White正式提出植物細胞具有全能性學說，即單細胞經(jīng)過人工培養(yǎng)，通過細胞分裂能恢復完整植株。 1934年，White 和Went 等分別發(fā)現(xiàn)B族維生素和吲哚乙酸（IAA）對培養(yǎng)的離體根生長具有重要作用。1937-1938年， Gautheret、Nobecourt 培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)

3、培養(yǎng)，可無限發(fā)生細胞增殖。,,,White、Gautheret、Nobecourt 等科學家被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人 1957年Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通過改變培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生長素和細胞分裂素高促進根的分化，低促進莖和芽的分化。1958年，施圖爾德從胡蘿卜愈傷組織獲得單細胞，并經(jīng)誘導形成了胚狀體再生了植株，是世界上首次證明植物細胞的全能性。③迅速

4、發(fā)展階段（60年代后） 1、原生質體培養(yǎng)和細胞融合。 2、微繁技術,,2.3 植物組織培養(yǎng)重要概念和理論基礎,植物組織培養(yǎng)：在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞、胚胎、原生質體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，或潛伏芽等，或長成完整的植株，統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng) 。,,,植物組織培養(yǎng)理論基礎一、細胞全能性二.細胞分化 三.離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化,,,全能性：任何有完整的細胞核的

5、植物細胞擁有形成一個完整植株所必需的遺傳信息，理論上都能發(fā)育成為一棵植株。 植物組織培養(yǎng)是建立在細胞具有全能性的理論基礎上的，除受精卵能發(fā)育成胚外，植物的體細胞，雌配子、雄配子體都能發(fā)育成胚。,,,植物細胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細胞類型不同從強到弱: 營養(yǎng)生長中心 > 形成層 > 薄壁細胞 > 厚壁細胞(木質化細胞) > 特化細胞(篩管、導管細胞)； 根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱為： 頂端分生組織 &

6、gt; 居間分生組織 > 側生分生組織 > 薄壁組織(基本組織) > 厚角組織 > 輸導組織 > 厚壁組織。,,,,脫分化 再分化 外植體―→愈傷組織 ―→ ↗體細胞胚 ↘ ↘根、莖、葉

7、 等器官再分化時，可經(jīng)過兩條途徑,,,,完整植株,,外植體：植物組織培養(yǎng)中用來進行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細胞或原生質體。愈傷組織：由外植體組織增生的細胞產(chǎn)生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。,,,,,,,二、細胞分化分化：細胞的這種在形態(tài)結構和功能上發(fā)生永久性（不可逆轉性）適度變化的過程。分化的結果導致細胞分裂能力的喪失，伴隨的是細胞的分化成熟與組織的形成

8、，是植物根、莖、葉、花、果實和種子的形成，是一個成熟植物體的出現(xiàn)。,,三.離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化脫分化：由失去分裂能力的細胞回復到分生性狀態(tài)并進行分裂，形成無分化的細胞團即愈傷組織的現(xiàn)象。再分化：由無分化的愈傷組織的細胞再轉變成為具有一定結構，執(zhí)行一定生理功能的組織，構成一個完整的植物體或植物器官的現(xiàn)象,,一個已分化細胞要表達出其全能性，就要經(jīng)過脫分化和再分化的過程，這就是植物組織和細胞培養(yǎng)所要達到的目的。,,影響細胞脫分化

9、、再分化的因素A、激素 生長素能促進維管組織形成 細胞分裂素與木質部的發(fā)生有關b、蔗糖濃度 C、光照與溫度光照對于維管組織的分化具有促進作用，適宜的溫度對于維管組織的分化是必需的。,,再分化時，可經(jīng)過兩條途徑 1、器官發(fā)生途徑2、體細胞胚胎發(fā)生途徑,1、器官發(fā)生途徑,植物的離體器官的發(fā)生：培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。離體培養(yǎng)中通過器官發(fā)生形成再生植株大體上有四種方式：

10、A: 先芽后根；如小麥，蘆薈、蘋果 B: 先根后芽；如枸杞、苜蓿C:在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。如胡蘿卜、石刁柏 D:僅有根或芽再生，形成無芽的根或無根的芽。,,器官分化的過程:愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過三個生長階段1.外植體經(jīng)過誘導形成愈傷組織。2.生長中心的形成。當把愈傷組織轉移到有利于有序生長的條件下以后，首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細胞群，稱之為生長中心或擬分生組織，它

11、們是愈傷組織形成器官的部位。3.器官原基及器官形成。生長中心形成后，按照其已確立的極性，某些細胞開始分化形成不同的器官原基，進而分化出相應的組織和器官。,,,愈傷組織分化不定芽,,,愈傷組織分化期,,,,,2、體細胞胚胎發(fā)生途徑,胚狀體發(fā)生途徑形成植株的特征1、具有兩極性 細胞發(fā)育早期階段，從其相反的兩端分化出芽端與根端，而不定芽和不定根都是單向極性。2、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結構上的聯(lián)系，而不定芽和不定根往

12、往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系3、胚狀體的維管組織的分布是獨立的“Ｙ”形，而不定芽和不定根的維管組織無此現(xiàn)象。4、發(fā)育過程與合子胚相似。并具有與合子胚類似的形態(tài)結構，可獨立萌發(fā)形成小苗。,,,2.4 植物組培的實驗條件,準備室：進行一切與實驗有關的準備工作：器皿洗滌、培養(yǎng)基配制與分裝、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌、培養(yǎng)材料的預處理等要求：20平方米左右。要求寬敞明亮設備：清洗區(qū)，干燥箱，工作臺，水箱，天平，滅菌鍋等。 無菌操作室：

13、 也叫接種室，進行材料的立體無菌操作，是植物離體培養(yǎng)研究或生產(chǎn)中最關鍵的一步。要求：10-20平方米即可，封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌.設備：超凈工作臺，紫外燈和空調,,培養(yǎng)室： 對接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體材料進行控制條件下的培養(yǎng)要求：約需10-20平方米左右?；疽笫悄軌蚩刂乒庹蘸蜏囟龋⒈３窒鄬Φ臒o菌環(huán)境，設備：培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱、溫濕度計、空調等。緩沖間：是進入無菌室前的一個緩沖場地，減少人

14、體從外界帶入的塵埃等污染物。工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能進入無菌室和培養(yǎng)室。要求：緩沖間需3-5平方米，可建在準備室外或無菌操作室外，應保持清潔無菌；備有鞋架和衣帽掛鉤，并有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過的工作服；墻頂用1-2盞紫外燈定時照射，對衣物進行滅菌。設備：1-2盞紫外燈、滅菌后的工作服、拖鞋、口罩。,,,基本實驗室 －－－－－準備室,,,,,,,,,,,,,培養(yǎng)室,,,,,,2.5 植物組織培養(yǎng)步驟,植物組織培

15、養(yǎng)兩個步驟：1、植物細胞或組織脫分化，形成愈傷組織。2、愈傷組織形成分生細胞團，再分化成不同的器官。 有的情況下，組織細胞經(jīng)脫分化后，不形成愈傷組織，而是從脫分化的細胞上直接再分化器官 到底通過哪個途徑再生，取決于培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基，尤其培養(yǎng)基中添加激素的種類、濃度及配比,,1、培養(yǎng)材料的采集選擇具全能性細胞：受精卵、分生組織細胞、雌雄配子及單倍體細胞常用植物莖尖、下胚軸、幼葉作為外植體。考慮因素：材料的來源、外植體

16、年齡、產(chǎn)地、外植體的大小、形狀、生理部位。,,（1）最常用的組培材料： 莖尖、莖段、皮層、表皮、維管組織、塊莖、花瓣、根、葉、子葉、胚珠、花藥等。 ① 莖尖：形態(tài)已建成，繁殖率高，不易產(chǎn)生變異。莖尖最先端為無病毒區(qū)。通常為0.5cm，無病毒區(qū)為0.1mm。 缺點：數(shù)量少，取材有限。 ② 莖段：一般為0.5～1cm長，取材方便。 缺點：所獲得的愈傷組織來源不一，有異質性，再生植株易產(chǎn)生變異。,,③ 葉：取材

17、方便，再生能力強 。 ④ 花器官：取材包括花托、花瓣、花藥、子房等。⑤ 種子（果實）：無菌種子發(fā)芽后可作外植體。子葉和下胚軸也可培養(yǎng)。,,2、培養(yǎng)材料消毒A:自來水沖洗、蒸餾水沖洗、無菌濾紙吸干。B:無菌操作將材料放入70%酒精浸泡30-60sC:將材料移入Naclo飽和液或0.01%升汞消毒8-10min。D:取出無菌水沖洗。,3、制備外植體：用消毒過的器械無菌操作將外植體置于培養(yǎng)皿上。 切取外植體為適當大小，一般0.2

18、-0.5cm。 4、接種和培養(yǎng)誘導培養(yǎng)基成分一般為基本培養(yǎng)基+細胞分裂素+生長素+附加成分, 基本培養(yǎng)基一般選擇MS配方（1）接種：每瓶約4～10個 （2）封口 （3）培養(yǎng)條件：溫度為25+2℃ 光照為1000～4000lx pH值常為5.6～6.0 培養(yǎng)室的相對濕度要常保持在70～80%。,,5、增殖 把在誘導培養(yǎng)基上分化出的幼芽繼代培養(yǎng)。 轉到增殖

19、培養(yǎng)基上進行培養(yǎng), 這是使幼芽快速增殖的關鍵環(huán)節(jié)。6、根的誘導 繼代培養(yǎng)的不定芽或側芽需要生根培養(yǎng)，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個月左右方可獲得根系。 7、組培苗的練苗移栽,,,煉苗與移栽,,,,切取,,,,,,,,,,,2.6 愈傷組織形成的過程,外植體中已分化的活細胞，在外源激素的誘導下通過脫分化后形成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個時期誘導期分裂期形成期,1、誘導期：細胞分裂的準備期 誘導期是細胞準備進行分裂，需加入誘導

20、劑或細胞分裂素。2、分裂期：細胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時期 。分裂期的愈傷組織的共同特征是：細胞分裂快，結構疏松，缺少有組織的結構，維持其不分化的狀態(tài)。,3、分化期：從愈傷組織到器官發(fā)生 。其間受很多因素影響。,,,愈傷組織的形態(tài),,,,愈傷組織的顏色,,愈傷組織的種類 1、胚性愈傷組織：表面光滑、組織結構緊湊、細胞小、再生力強。 胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。 2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結構疏松

21、、細胞大。,,,,,復 習,愈傷組織再分化經(jīng)歷兩個途徑：器官發(fā)生方式再生植株的三種 途徑： ① 可能先長芽后長根（常見）。 ② 形成根，根上再長出芽（少見）。 ③ 在愈傷組織不同部位分別形成根和芽。,,胚狀體形成途徑 胚狀體：指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀結構。 體細胞胚與合子胚發(fā)育過程相似： 原胚 → 球形胚 → 心形胚 → 魚雷形胚 → 子葉型胚,,,胚狀體發(fā)生途徑,,外

22、 植 體 ↓ 高濃度生長素（2,4-D） 脫 分 化 ↓ 愈傷組織 ↓ 高（細胞分裂素/生長素） 再 分 化 ↓ 形 成 芽 ↓ 低（細胞分裂素/生長素） 分 化 根

23、↓ 完整植株,,,,,激素控制器官分化模式圖,植物組織培養(yǎng)舉例,一、材料和培養(yǎng)基l0-l5cm高的蘆薈幼苗;愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+(1一6mg/ L)BA+(0.1一0.5mg/L)NAA;分化培養(yǎng)基為MS+(2-4mg/L)BA+ (0.1-0.5mg/L)NAA;生根培養(yǎng)基為MS+(0.1一0.5mg/L)IBA+(2一5mg/L)PP33。,二、繁殖方法 (一)愈傷組織培養(yǎng) 將準備好的蘆薈幼苗在

24、清水中沖洗數(shù)次，剪去葉片和大部分莖段，取莖尖部分，再沖洗1-2次，淋干。在超凈臺上，先用75%的乙醇將莖尖浸泡30-60s，再用升汞浸5-l0min，最后用無菌水沖洗數(shù)次。用解剖刀取出包括莖尖生長點的組織切塊，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。大約15-25d后，試管中接種的外植體就可以膨大，形成愈傷組織。愈傷組織的形成標志著接種的外植體的生長狀態(tài)已脫離分化狀態(tài)，開始重新恢復分生能力。愈傷組織形成1周后，就可將愈傷組織轉管進行繼代培養(yǎng)或分化培

25、養(yǎng)。(二)繼代培養(yǎng) 將愈傷組織在無菌條件下，用解剖刀將愈傷塊切成數(shù)個小塊，再接種到裝有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的三角瓶中，在與誘導愈傷組織相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。幾天后，小愈傷塊即可逐漸長大，這一過程稱作繼代培養(yǎng)。通過愈傷組織的繼代培養(yǎng)，原來接種的1個蘆薈莖尖組織可繁殖出大量的新接種材料來，用于分化培養(yǎng)。,(三)分化培養(yǎng) 將愈傷組織在無菌條件下，從試管或三角瓶中取出，用無菌水洗凈，切成小接種塊，接種到裝有分化培養(yǎng)基的三角瓶中，分化培養(yǎng)的條

26、件同愈傷組織培養(yǎng)。大約30-50d后，愈傷組織就可分化出芽，并繼續(xù)長出小葉片。當分化出的幼苗長到一定高度或分化出一定數(shù)量后，將這些小幼苗在無菌條件下取出，進行生根培養(yǎng)或重新誘導分化。(四)生根培養(yǎng) 當三角瓶中的幼苗葉片長到3cm左右時，將幼苗在無菌條件下取出，放入裝有生根培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同分化培養(yǎng)。大約半個月后，幼苗即可生根。(五)煉苗 當幼苗的根長到一 定長度，幼苗形體已顯健壯時。將幼苗取出，在清水中洗除附著在根上的

27、培養(yǎng)基(注意:一定要嚴格洗凈，否則會爛根)。(六)移栽 煉苗后，將幼苗移栽入由蛭石組成的馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15-20d后，視幼苗長勢，即可移栽到苗圃中。,,,1、在植物育種上的應用 突變育種：無論是愈傷組織培養(yǎng)還是細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條件和外界壓力的影響而產(chǎn)生誘變，從中可以篩選出對人們有用的突變體，從而育成新品種。原生質體融合和細胞雜交：可部分克服有性雜交不親和性

28、，而獲得體細胞雜種，從而創(chuàng)造新種或育成優(yōu)良品種。單倍體育種：利用花藥培養(yǎng)誘導花粉形成單倍體，在試管培養(yǎng)中通過秋水仙素處理，使染色體加倍，而成為純合二倍體植物，從而縮短新品種育種的時間，還有利于突變中隱性突變的分離。,2.7 植物組織培養(yǎng)的應用,,,2、在植物脫毒和快速繁殖上的應用　植物脫毒和離體快速繁殖是目前植物組織培養(yǎng)應用最多、最有效的一個方面。很多農(nóng)用物都帶有病毒，特別是無性繁殖植物，但是，患病植株并非每個部位都帶有病毒，利

29、用組織培養(yǎng)方法，取一定大小的莖尖進行培養(yǎng)，再生的植株有可能不帶病毒，從而獲得脫病毒苗，再用脫毒苗進行繁殖，則種植的作物就不會或極少發(fā)生病毒。,,,,,馬鈴薯脫病毒試管苗,,由于組織培養(yǎng)法繁殖作物的突出特點是快速，因此，對一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖的“名、優(yōu)、特、新、奇”作物品種的繁殖，意義更大。對于脫毒苗、新育成、新引進、稀缺育種、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等可通過離體快速繁殖，同時可不受地區(qū)、氣候的影響，比常規(guī)方法快數(shù)萬倍到

30、數(shù)百萬倍的速度擴大繁殖，及時提供大量優(yōu)質種薯和種苗。,,3、在植物種質資源保存和交換上的應用 由于自然災害和生物之間的競爭以及人類活動對大自然的影響，已有相當數(shù)量的植物物種在地球上消失或正在消失。具有獨特遺傳性狀的生物物種的絕跡是一種不可挽回的損失。利用植物組織和細胞法低溫保存種質，給保存和搶救有用基因帶來了希望。例如胡蘿卜和煙草等植物的細胞懸浮物，在-20℃至-196℃的低溫下貯藏數(shù)月，尚能恢復生長，再生成植株。,2.8 人工種子

31、,2.8.1 人工種子理論基礎胚狀體： 是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀結構，又稱體細胞胚。 A: 體細胞胚胎發(fā)生特點1、是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物2、起源于非合子細胞3、發(fā)育過程與合子胚相似，也經(jīng)歷球形期、心形期、 魚雷期和子葉期階段。,,B: 體細胞胚胎發(fā)生途徑 胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種：,直接從器官外植體上發(fā)生愈傷組織發(fā)生懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生單

32、倍體細胞發(fā)生原生質體發(fā)生,,,,2.8.2 人工種子概念,利用人工種皮包被體細胞胚可以制造人工種子。 人工種子的結構農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種被、胚乳和胚三部分構成。 目前研制的人工種子的結構: 體細胞胚 人工種皮 人工胚乳,,,2.8.3 人工種子的基本制作流程 外植體的選擇和消毒—— 愈傷組織的誘導——體細胞胚的誘導 ——體細胞胚的同步化—

33、—體細胞胚的分選——體細胞胚的包裹(人工胚乳)——包裹外膜——發(fā)芽成苗試驗——體細胞胚變異程度與農(nóng)藝研究。,,人工種子制作過程中，包埋是最重要環(huán)節(jié)包括包埋介質的選擇，主要是人工胚乳和人工種皮的選擇人工胚乳一般由含有供應胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成,養(yǎng)分包括礦質元素、維生素、碳源以及激素等,,對于人工胚乳包埋介質的要求： 首先必需是對繁殖體及其它生物是無毒的，并具有一定的緩沖強度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運輸和種植操作中的安全。 同

34、時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質，以供繁殖體發(fā)芽的需要。 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質中還應含有適當?shù)臍⒕鷦?。海藻酸鈉作包埋劑,2.8.4 人工種子優(yōu)點：第一，它同微繁殖技術一樣，培養(yǎng)條件可以人為控制，免遭大自然災害性氣候的不利因素，且具有省地省工可直接在田間播種等優(yōu)點。第二，在人工種子制作中，可加入營養(yǎng)物質、植物生長調節(jié)劑、固氮菌、殺蟲劑等，這是微繁殖難以達到的。第三，用于制作人

35、工種子的體細胞胚，可利用生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率。第四，一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術加速用于生產(chǎn)。,2.9 植物細胞培養(yǎng),2.9.1 概念：離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)。得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖。從而獲得大量細胞群體的一種技術。方法：根據(jù)對象：單細胞培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)。按培養(yǎng)系統(tǒng)：懸浮培養(yǎng)、液

36、體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)圖3-7,2.9.2 植物單細胞培養(yǎng),1、單細胞制備方法由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織中分離單細胞A: 機械法：通過機械磨碎、切割植物體獲得游離單細胞。B: 酶解法：采用水解酶去除細胞壁，釋放出細胞，用來制備原生質體。葉片是分離單細胞的最好材料,機械法,,,,,Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞,,C: 愈傷組織誘導法：先獲得愈傷組織，在通過震蕩獲得單個細

37、胞步驟：(1) 誘導產(chǎn)生愈傷組織； (2) 愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。(3)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。,2、單細胞培養(yǎng)方法,A: 平板培養(yǎng)法概念：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，接種在1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)1、單細胞懸浮液的制備 2、懸浮細胞密度的調制3、瓊脂培養(yǎng)基的配制4、平板制作 5、培養(yǎng),,主要技術要點： 

38、;單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞，因此過濾時網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調整密度為103或105個細胞/ml,,植板：將1份已調整好密度的單細胞懸浮液與35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm。 待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)皿封嚴以防污染.在25℃黑暗條件下培養(yǎng)3周即可長出肉眼可見的愈傷組織。,,特點：單細

39、胞在培養(yǎng)集中分布均勻，便于顯微鏡下定點觀察；培養(yǎng)細胞氣體交換不暢。,,,,平板培養(yǎng)法,,B: 看護培養(yǎng)法 用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。（1）取處于活躍生長期約1厘米大小愈傷組織塊。（2）無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約1厘米平方的無菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過夜。（3）將分離出的單細胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。（4）恒溫培養(yǎng)。,,特點：（1）效果好，易于成功。（

40、2）簡便易行。（3）不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程。,,C: 微室培養(yǎng)法 人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。小室可通過毛細管與外界通氣，便于觀察。,,,微室培養(yǎng),,,,,1滴含單細胞培養(yǎng)液,周圍加石蠟油,,,,,凹穴載玻片,,旁邊加石蠟油,,,,,,蓋蓋玻片,,,,,,,,蓋蓋玻片,,,,,,,,,,,,,,,,,,置培養(yǎng)皿中26~28 ℃恒溫培養(yǎng),,,特點：

41、在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進行顯微觀察，將一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程記錄下來。,D: 其它單細胞培養(yǎng)技術飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術 是用處理過的、無活性或分裂慢的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。將飼養(yǎng)細胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)細胞混合植板，經(jīng)過照射的細胞對于培養(yǎng)細胞起到一個飼養(yǎng)作用。雙層濾紙植板培養(yǎng)方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,培養(yǎng)基,,飼養(yǎng)層細胞,,看護濾紙層,,轉移碟濾紙,,培養(yǎng)細胞,

42、,,E: 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。1、起始培養(yǎng)物的建立選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。2、選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質。愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強,,懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點：一、增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應；可以適當改善氣體的交換二、在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質在局部積累

43、而對細胞自身產(chǎn)生毒害；三、適合大規(guī)模培養(yǎng)。生產(chǎn)有價值次生代謝產(chǎn)物。,,3、建立細胞懸浮系,,一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件： 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。 均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可

44、增加一倍。,104,4、懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算,細胞計數(shù)細胞密實體積（PCV）,5％鉻酸或0.25％果膠酶使懸浮細胞團分散用血球計數(shù)板進行。,,將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個 15ml 的離心管中，2000轉下離心，用每ml培養(yǎng)液中細胞總體積的ml數(shù)表示,細胞鮮重：細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽慮，稱重。細胞干重離心收集的細胞轉移到預先稱重的濾紙片上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷卻后稱重,5、懸浮細胞培養(yǎng)

45、的同步化,細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。1、物理方法1）分選法通過細胞體積大小分級，直接將處于相同周期的細胞進行分選，然后將同一狀態(tài)的細胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中 。2）冷處理法。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度,2、化學方法1）饑餓法 懸浮培養(yǎng)細胞中，若斷絕供應一種細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓之后，當在培養(yǎng)基中重新加入

46、這種限制因子時，靜止細胞就會同步進入分裂。2）抑制劑法 通過一些DNA 合成抑制劑處理細胞，使細胞停留在DNA 合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期的細胞。 常用的抑制劑有5-氟脫氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羥基尿等。3）有絲分裂阻抑 用秋水仙素處理指數(shù)生長的懸浮培養(yǎng)物，濃度一般控制在0.2%，處理時間以4-6小時為宜,植物細胞培養(yǎng)的意義,2.10植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領域具有重要意義。 &

47、#160;李時珍（1593）在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。,,許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。例如：從胡蘿卜、萬壽菊提取色素從黃菊提取芳香油梔子提取果酸：果酸含有大量的維生素，如維生素C、檸檬酸等。主要用作食品的調味劑，化妝行業(yè)用于

48、制作護膚品和洗發(fā)香波等，美容院用作換膚液,2.11 植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng),目前采用液體培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)1、植物細胞培養(yǎng)的特性a 植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞壁．細胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；b 培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；c 細胞生長的中期及對數(shù)期．易凝聚為團塊，懸浮培養(yǎng)較難；d 培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大：e 具有群體效應；f 因為有細胞壁, 培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，產(chǎn)量較低；

49、g 細胞培養(yǎng)過程具有結構與功能全能性,因而易分化,從而導致目的產(chǎn)物低于原植物體內(nèi)的濃度；h 懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細胞濃度，否則不生長。,2．植物細胞培養(yǎng)液的流變特性 易結團，易分泌粘性物質。傳氧速率降低，影響細胞生長。 3．植物細胞培養(yǎng)過程中的氣體傳遞與影響 （1）氧的傳遞 （2）CO2的影響,,,4．泡沫與器壁表面黏附性 易產(chǎn)生泡沫，與器壁表面黏附性強，影響細胞生長，要盡量消除。 5．細胞分裂和愈傷組織的形成

50、 3～5天:發(fā)生細胞分裂 兩周后:愈傷組織的形成 將其轉移至分化培養(yǎng)基上即可最終獲得試管苗。,2、液體懸浮培養(yǎng)理論基礎---細胞生長曲線,在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長停止的細胞周期。細胞的生長呈S型曲線,滯后期,對數(shù)生長期,直線生長期,緩慢期,靜止期,1,2,3,4,5,3、懸浮細胞增殖各個時期的特點：,緩慢期,滯后期（延遲期）,細胞很少分裂，其長短與接種量大小和繼代時原

51、種細胞所處的生長期有關,對數(shù)生長期,細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變,直線生長期,細胞生長和發(fā)育最明顯的時期,生長逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質增多，氧氣減少,靜止期,生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。,4、大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程： （1）細胞的篩選與細胞株的建立（固液培養(yǎng)相結合）篩選細胞株的方法是：（1）愈傷組織的誘導與培養(yǎng)：將切取得材料放在培養(yǎng)基上，愈傷組織形成后，繼代培養(yǎng)。（2）單細胞

52、分離：挑選出外觀疏松、生長快的淺色愈傷組織轉移到液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，也可加入果膠酶，游離出單個細胞或小細胞團。（3）無性系的分離：將懸浮培養(yǎng)物經(jīng)過不銹鋼網(wǎng)過濾除去細胞塊，濃縮后接種與固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。（4）細胞株篩選：在平板上選擇生長迅速分散好的胞系的培養(yǎng)物，進行有效成分的測定，篩選出有效成分高而生長較快的細胞株。（2）擴大培養(yǎng)將優(yōu)良細胞株多次擴大繁殖得到大量細胞，用作生物反應器的種子,(3)生物反應器培養(yǎng)培養(yǎng)方式（一

53、）分批培養(yǎng)/成批培養(yǎng)是指細胞接種到一定容積培養(yǎng)基的密封系統(tǒng)中培養(yǎng)， 它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。要進行下一批培養(yǎng)，則生長一定時間后，需要繼代轉移。 特點：（1）細胞生長在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為細胞耗盡為止。（2）用適當攪拌的方法增加和維持游離細胞和細胞團在培養(yǎng)基中的均勻分布。（3）培養(yǎng)過程中，細胞生長，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈S增長。（4）成批培養(yǎng)結束后，若要進行下一批培養(yǎng)，

54、必須另外進行繼代培養(yǎng)，其方法是用注射器吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。,,,最佳繼代時期： 了解細胞數(shù)目增長變化S形曲線后，選擇對數(shù)生長期和直線 生長期！,,（二）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)反應器，在投料和接種培養(yǎng)后，以一定速度連續(xù)采集細胞與培養(yǎng)液，以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細胞生長環(huán)境長期維持穩(wěn)定,封閉式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞數(shù)目不斷增加。開放式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中

55、的細胞密度保持恒定。,,連續(xù)培養(yǎng),加入培養(yǎng)基,排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物,二者體積相等,分：開放式連續(xù)培養(yǎng)（Open C.C） 封閉式連續(xù)培養(yǎng)（Closed C.C）,,開放式和封閉式區(qū)別封閉式中：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加；開放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出，培養(yǎng)細胞數(shù)目保持恒定；通過調節(jié)流入和流出的速度，使培養(yǎng)物的生長速度永遠保持接近最高值的恒

56、定水平上。,,（三）半連續(xù)培養(yǎng) 在反應器中培養(yǎng)，一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進行交換或添加某種營養(yǎng)成分的培養(yǎng)。 能重復地取得大量、均一的培養(yǎng)細胞，供生物研究之用。,5.植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)------生物反應器類型機械攪拌式、鼓泡式和氣升循環(huán)式機械攪拌式：優(yōu)點：攪拌均勻。缺點：剪切力大。氣動式培養(yǎng)系統(tǒng)：優(yōu)點：剪切力小缺點：操作彈性小，低氣速或培養(yǎng)后期混合效果差；此時如果提高通氣量又會產(chǎn)生大量泡沫。,,,

57、,機械攪拌式生物反應器,,,,氣動式生物反應器,6. 植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)-------培養(yǎng)細胞和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的影響因素（1）細胞遺傳特性 分清代謝物的合成部位或貯藏部位。（2）培養(yǎng)的環(huán)境條件包括光照、溫度、通氣、培養(yǎng)基成分、PH、調節(jié)因子等培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基的成分包括培養(yǎng)條件要通過一定的實驗才能選擇出既有利于細胞大量生長繁殖又有利于次生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生的培養(yǎng)基。 通氣：KLa（體積氧傳遞系數(shù)，單位時間、單位體

58、積氧量）：如在15L的通風式反應器中培養(yǎng)的煙草細胞，當 KLa值在5－10h-1的范圍內(nèi)，隨著 KLa的增加，生物量和代謝產(chǎn)物也呈線性增加 激發(fā)子:植物細胞次生代謝除了自身的遺傳或發(fā)育基礎外，通常還與誘導因子有關。人為合理的應用這些誘導因子，就有可能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。,有用次生代謝物質,,,（3）培養(yǎng)方法(兩階段培養(yǎng)工藝）為了同時滿足細胞生長和產(chǎn)物合成的需要，通常需要在不同階段使用不同的培養(yǎng)基，即兩階段培養(yǎng),,兩階段培養(yǎng)方法：

59、一步法逐級放大：對于細胞生長與目的產(chǎn)物合成同步的類型，一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。 兩步法：用于目的產(chǎn)物合成在細胞生長發(fā)育到一定時期進行，細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，再將其轉入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。,,植物細胞生物反應器培養(yǎng)存在的主要問題 （1）攪拌或通氣對細胞有損傷，泡沫產(chǎn)生、有益氣體散失對細胞代謝不利。 （2）培養(yǎng)液粘度增加，影響細胞吸收營

60、養(yǎng)及氣體傳遞。 （3）反應器結構有缺陷。 （4）相關代謝機制不清楚。,,2.12 植物細胞兩相培養(yǎng)技術為了解決產(chǎn)物對合成的反饋抑制可以采用兩相培養(yǎng)技術。兩相培養(yǎng)技術：在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，是培養(yǎng)體系形成上下兩相，細胞在水相上生長，合成的次生代謝物質分泌出后轉移至有機相中。,,優(yōu)點： 減少產(chǎn)物反饋抑制 提高產(chǎn)物產(chǎn)量 實現(xiàn)培養(yǎng)連續(xù)性,,2.13 生物反應器固定化培養(yǎng)

61、固定化培養(yǎng)：是指將游離的細胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中、培養(yǎng)液成流動狀態(tài)進行無菌培養(yǎng)的一門技術。,,* 細胞固定化具有以下意義： （1）細胞生長較慢，有利于次生代謝物的積累。 （2）易控制化學環(huán)境、收獲次生代謝產(chǎn)物。 （3）細胞經(jīng)包埋后受剪切力損傷小。 （4）有利于進行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉化。,,細胞固定化培養(yǎng)技術按照其支持物不同可以分為兩大類： 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽b、聚丙烯酰胺

62、等； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。固定化方法：滴入CaCl2使海藻酸鹽形成顆粒,,固定化培養(yǎng)反應器：① 流化床生物反應器： 細胞包裹在膠粒、金屬或泡沫顆粒中。 優(yōu)點：細胞包埋顆粒小，傳質效率高。 缺點：剪切力或碰撞破壞細胞。,,② 填充床生物反應器： 細胞固定在膠粒、金屬或泡沫顆粒或連續(xù)多個網(wǎng)中，或位于支持物表面。細胞固定不動。 優(yōu)點：單位體積容量大。 缺點：混合

63、效率低、傳質效率低，顆粒或碎片易阻塞液體流動，高溫變形的固定材料易阻塞。③ 膜生物反應器 常用中空纖維和螺線式卷繞反應器。 缺點：傳質效率低、易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。,,培養(yǎng)技術的選擇包括對反應器的選擇和對培養(yǎng)方式的選擇，就目前的技術基礎來講，固定化培養(yǎng)是植物細胞規(guī)模化生產(chǎn)較為理想的系統(tǒng)。,2.13 植物原生質體培養(yǎng),2.13.1 原生質體概念及特點原生質體定義：去掉細胞壁的由質膜包裹著的裸細胞。特點：1、

64、無細胞壁障礙，可以方便的進行有關遺傳操作2、具全能性，能人工培育發(fā)育成完整植株。3、適合進行誘導融合形成雜種細胞,,用途： 1、原生質體沒有細胞壁，有利于細胞融合，體細胞雜交，基因轉移和單細胞培養(yǎng)。2、原生質體能比較容易攝取外來的遺傳物質，作為理想的受體系統(tǒng)進行各種遺傳操作的研究，,2.13.2 原生質體的分離與純化 原生質體材料來源：葉片，花瓣，果實組織，子葉等，尤其是葉肉細胞及由各部分形成的培養(yǎng)細胞和懸浮細胞。分

65、離方法：1、機械分離法 產(chǎn)生質壁分離——釋放原生質體2、酶分離法收率高、活力強、完整性好。分離原生質體最有效。 分離原生質體的酶多是一些復合酶制劑，以其所含的主要酶的作用分為 1、纖維素酶類 2 半纖維素酶類 3 果膠酶類 4 崩潰酶 5 蝸牛酶。,,原生質體分離（以葉片為例） 取材消毒：酶解處理時把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。對于懸浮細胞等材料，如果細胞團

66、的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龍網(wǎng)篩過濾一次，將原細胞團去掉，留下較均勻的小細胞團時再進行酶解。,,酶解：1、兩步分離法。用果膠酶離析植物組織，收集細胞，經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細胞壁，然后獲得原生質體。2、一步分離法。一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進行一次性處理。,,2.13.3 原生質體的收集純化方法1、離心沉淀法鎳絲網(wǎng)濾出液 置于離心管（離心2-3分鐘，原生質體沉于離心管底部，殘液碎屑懸浮于上清液）

67、 棄去上清液 再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中（反復3次） 2、漂浮法根據(jù)原生質體來源不同，利用比重大于原生質體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。,,,,,3、沉降法和漂浮法結合 將收集的原生質體低速離心，傾去上清，將沉降得到的原生質體重新懸浮于蔗糖純化液中，離心，收集表面懸浮的原生質體。再將原生質體重新懸浮于洗滌液中，離心收集沉于底部的原生質體。重復操作,,2.13.4 原生質體鑒定

68、與活力測定一、原生質體鑒定1、低滲爆破法：把原生質體放入低滲溶液中，顯微鏡下觀察原生質體從低滲溶液中吸水漲破的過程。2、熒光染色法：用熒光增白劑溶液對原生質體染色，在熒光顯微鏡下觀察，綠色顯示纖維素的存在，紅光是沒纖維素的真正原生質體,,二、活力測定 1、目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質體活力。 如形態(tài)上完整，含有飽滿的細胞質，顏色新鮮的原生質體即為存活的。 2、染色識別A: FDA法

69、： FDA本身沒熒光，進入細胞后被脂酶分解為具熒光的極性物，不能透過質膜，而是留在細胞內(nèi)發(fā)光。B:其他染色方法,,FDA法,,2.13.5 原生質體培養(yǎng)方法1、液體淺層培養(yǎng)將含有原生質體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)。一般直徑3cm加1-1.5ml培養(yǎng)液，6cm加2-3ml,5-10天后開始原生質體分裂優(yōu)點：操作簡單，原生質體代謝物易擴散，防止有害物質積累過多造成毒害，易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物。 缺點：是原