懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)講義

1、懸浮細胞傳代及細胞計數(shù)懸浮細胞傳代及細胞計數(shù)一、一、細胞傳代細胞傳代實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模赫莆諔腋〖毎麄鞔夹g(shù)。進一步掌握細胞培養(yǎng)的操作技術(shù)。實驗原理：實驗原理：培養(yǎng)細胞生長一定時間后，需分離再培養(yǎng)，否則細胞因生存空間不夠，細胞密度過大，致營養(yǎng)不足而引起細胞衰老、停止生長甚至死亡。為了維持細胞的存活和生長，必須進行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴大培養(yǎng)。實驗用品：實驗用品：（一）儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴

2、箱、冰箱（4℃、20℃、70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；（二）玻璃器皿吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、廢液缸、（三）塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架（四）其他物品微量加樣槍、計數(shù)板、記號筆、移液槍（五）試劑1640培養(yǎng)液、PBS操作步驟：操作步驟：1.準備：打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度

3、。3.首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個孔中的細胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培養(yǎng)板孔中，輕輕吹打孔壁，inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（piledup）。細胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數(shù)仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細

4、胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導致細胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（DensityInhibition）。（3）停滯期(Stagnatephase)細胞數(shù)量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時細胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateauphase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發(fā)生死

5、亡，因此，應(yīng)及時傳代。實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?.能獨立的進行細胞技術(shù)，會繪制生長曲線，了解細胞生長的發(fā)育特性。2.學習在科研中如何應(yīng)用生長曲線實驗原理：實驗原理：生長曲線的測定（計數(shù)法）是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，為培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中的細胞數(shù)目的

6、動態(tài)變化，需連續(xù)對細胞進行計數(shù)，通常計數(shù)7天。為精確起見，一般每次計數(shù)三瓶細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細胞數(shù)對培養(yǎng)時間做圖，即生長曲線。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1312處加藥。細胞技術(shù)的時間和次數(shù)依實驗?zāi)康亩?。另外，測定生長曲線的常用方法還有MTT法。計數(shù)板原理：計數(shù)板原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中