細(xì)胞培養(yǎng)從頭學(xué)

1、常用設(shè)備準(zhǔn)備室的設(shè)備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品規(guī)（放置消毒過的物品）、包裝臺(tái)。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測(cè)量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置

2、顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。無菌操作無菌室的滅菌：1、定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。2、CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射3、實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各2030分鐘4、實(shí)驗(yàn)后滅菌：用7

3、5％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備：1、肥皂洗手。2、穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3、用75％酒精棉球擦凈雙手。無菌操作的演示：1、凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2、靠近酒精燈火焰操作。3、器皿使用前必須過火滅菌4、繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火。5、各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰

4、。如吸管不能碰到廢液缸。6、吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：1、自來水刷洗，除去灰塵。2、烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。3、刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。4、泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈

5、出器皿用自來水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗35次和用雙蒸水過3次。5、烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。6、高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持2030分鐘。7、高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：1、刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。2、泡酸、清洗

6、：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。3、烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再1、稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（Dhanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。2、用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶

7、溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于20℃保存以備使用。四、青、鏈霉素溶液的配制于消毒1、所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。2、具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬單位瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。3、使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位ml。1單位＝1微克？五、RPMI1640的制備與消毒：1

8、、溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積23的雙蒸水中并用雙蒸水沖洗包裝袋23次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中)充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙獠凑瞻b說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml使青鏈霉素的濃度最終各為100單位ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。2、安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支

9、架腿分別用布包好待消毒。3、抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾。4、分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。5、使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時(shí)兩周有效）。六、血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。七、HEPES溶液：HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’ahydroxythy

10、lpiperazineN’ethanesulfanicacid）。對(duì)細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為1050mmolL，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmolLHEPES即可達(dá)到緩沖能力。1molLHEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液

11、內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20mmolL。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。八、谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置

12、于20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmolL?？梢耘渲?00mmolL谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmolL的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。九、肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使

13、內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ugml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為℃。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。十、Ⅰ型膠原酶：0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶20℃保存