細胞培養(yǎng)技術(shù)

1、淺談細胞培養(yǎng)技術(shù),陳巧玲2017-9-17,主要內(nèi)容,細胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備細胞的原代培養(yǎng)細胞的傳代培養(yǎng)細胞凍存與復(fù)蘇培養(yǎng)細胞的污染,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,離心機,櫥柜,實驗臺,冰箱,培養(yǎng)箱,試劑柜,實驗儀器臺,超凈工作臺,實驗臺,,實驗臺,實驗臺,實驗臺,,水池,冰箱,衣柜,實驗臺,顯微鏡,遞物窗,緩沖間,無菌操作室,準(zhǔn)備室,,,,,,1.細胞培養(yǎng)室設(shè)置,一、細胞培養(yǎng)前的實驗準(zhǔn)備,,,,,,,,下風(fēng)口,上風(fēng)口,無

2、菌操作室,超凈工作臺和CO2培養(yǎng)箱,2.細胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％CO2 使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒③箱內(nèi)蒸餾水槽中預(yù)留滅菌蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)

3、液蒸發(fā)。,解剖顯微鏡,倒置顯微鏡,2.細胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備,血清（天然成分）：,基礎(chǔ)培養(yǎng)基（人工合成）：干粉培養(yǎng)基DMEM 、α-MEM、RPMI1640,水：高純度的去離子水,3.細胞培養(yǎng)的主要試劑（培養(yǎng)基）,,抗菌素：通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，使用濃度為100U/ml,,消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使細胞脫離組織或容器壁， 用含血清培養(yǎng)液中止其活性,4.細胞培養(yǎng)用器皿的清洗和消毒,? 一般玻璃器皿的清洗分為

4、四個步驟：1、自來水浸泡2、洗滌劑刷洗(如有必要進行超聲處理）3、泡酸（濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水）4、流水沖洗過夜，依次用蒸餾水、三蒸水漂洗，最后烘干備用,常用消毒方法：1、濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌），15磅，15～20min2、過濾除菌(如：血清的除菌）,細胞培養(yǎng)(cell culture)是指細胞的離體培養(yǎng)，是在無菌條件下，把動物或植物的細胞從機體中分離出來，置于培養(yǎng)皿中，并在一個合適的環(huán)境中，給以營養(yǎng)物質(zhì)，使之繼續(xù)生存

5、和繁殖的方法。,細胞培養(yǎng)（Cell Culture）,,細胞培養(yǎng)的基本概念,培養(yǎng)細胞的類型,貼附型成纖維樣細胞型上皮樣細胞型 懸浮型,,細胞培養(yǎng)的基本概念,培養(yǎng)人真皮成纖維細胞,培養(yǎng)人口腔上皮細胞,培養(yǎng)的骨髓瘤細胞,貼附型細胞的生長特性,細胞的貼壁生長 接觸抑制 細胞的生長曲線,細胞貼壁延展過程(模式圖),,細胞培養(yǎng)的基本概念,細胞的接觸抑制現(xiàn)象,正常培養(yǎng)細胞的生長曲線,,,,,,,,,,,,,,,退化死亡,平臺期,細胞數(shù)

6、增大極限點，出現(xiàn)接觸抑制,細胞指數(shù)生長極限點,指數(shù)生長期,潛伏期,細胞數(shù)量,0,24,48,72,96,120,小時,指數(shù)生長期是最佳實驗期 !,原代培養(yǎng)，或稱為初代培養(yǎng)，就是從供體取下組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物。常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。,二、原代培養(yǎng),,實驗準(zhǔn)備 取材、分離細胞 原代培養(yǎng) 維護培養(yǎng),,小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng),著裝,操作者進入無菌室前先用肥皂洗凈雙手，然后用1‰ 新

7、潔爾滅浸泡消毒5分鐘,原代培養(yǎng)的一般流程,原代培養(yǎng)的一般流程,,小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng),將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰ 新潔爾滅浸泡消毒，迅速進入無菌室。,用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪,實驗準(zhǔn)備 取材、分離細胞 原代培養(yǎng) 維護培養(yǎng),實驗準(zhǔn)備 取材、分離細胞 原代培養(yǎng) 維護培養(yǎng),,小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng),原代培養(yǎng)的一般流程,組織塊培養(yǎng)法,原代培養(yǎng)方法,消化法,,,,,原代培養(yǎng)

8、流程圖：組織塊法,原代培養(yǎng)流程圖：組織塊法,原代培養(yǎng)流程圖：消化法,原代培養(yǎng)流程圖：半消化法,小鼠胚胎成纖維細胞原代培養(yǎng),三、傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)，在原代培養(yǎng)物鋪展為單細胞層后，將原代培養(yǎng)細胞分開接種到兩個或多個新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)增殖。,,,,,細胞的傳代培養(yǎng),將原代培養(yǎng)物分割后重新接種到兩個或多個培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，這一操作稱為傳代培養(yǎng),傳代比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異.細胞傳代培養(yǎng)的意義傳代時機的把握傳代培養(yǎng)的代數(shù)限制

9、；少數(shù)細胞可出現(xiàn)永生化,吸去舊液,,加入消化液解離細胞約5min,,在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈圓粒狀,,,細胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,PBS洗 滌1~2次,,吹打懸浮細胞,調(diào)整細胞密度,分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液,,,培養(yǎng)細胞的觀察,細胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,培養(yǎng)細胞的觀察,,培養(yǎng)液顏色、是否清亮,培養(yǎng)細胞的狀態(tài),細胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,吸去舊液,,加入消化液解離細胞約5min,,在

10、倒置顯微鏡下觀察，細胞呈圓粒狀,,,PBS洗 滌1~2次,,吹打懸浮細胞,調(diào)整細胞密度,分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液,,,培養(yǎng)細胞的觀察,吸去舊液,,加入消化液解離細胞約5min,,在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈圓粒狀,,,細胞的傳代培養(yǎng)：貼附型,PBS洗 滌1~2次,,吹打懸浮細胞,調(diào)整細胞密度,分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),,在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液,,,培養(yǎng)細

11、胞的觀察,中止消化、吹散細胞,離心，收集細胞,細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)密度,按比例分割，接種至新培養(yǎng)瓶,細胞的傳代培養(yǎng)：懸浮型,四、細胞的凍存與復(fù)蘇,細胞低溫冷凍貯存是細胞間的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、減少經(jīng)費、減少污染、減少細胞生物學(xué)特性變化，最大限度的保存細胞活力。,細胞凍存與復(fù)蘇的原則：慢凍快融,低溫保護劑的應(yīng)用,細胞凍存方法,程序降溫儀,細胞凍存盒,,,,五、培養(yǎng)細胞的污染,所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分