植物單細胞培養(yǎng)概論

1、植物單細胞培養(yǎng)概論,,一、植物單細胞培養(yǎng)相關(guān)概念,1、植物的單細胞培養(yǎng)： 在適宜的條件下，一個來自已分化的根、莖、葉等組織的細胞，經(jīng)過離體培養(yǎng)可以發(fā)育成同其親本一樣的完整植株。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的重要理論基礎(chǔ)是植物細胞的全能性 植物的單細胞培養(yǎng)，在無菌和人為控制外因的條件下，培養(yǎng)、研究植物組織器官，甚至進而從中分化、發(fā)育出整個植株的技術(shù)。,2、愈傷組織： 原指植物體受傷時產(chǎn)生于傷口周圍

2、的組織。現(xiàn)多指切取植物體的一部分，置于含有生長素和細胞分裂素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生的無定形的組織團塊。 3、外植體： 把由活植物體上切取下來以進行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體,,愈傷組織例圖,二、植物組織培養(yǎng)特點及其意義,特點： ①培養(yǎng)條件可以人為控制 ②生長周期短，繁殖率高 ③管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制意義：①研究細胞生理代謝過程及各種影響因子； ②用于植

3、物品種的改良； ③用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn),三、細胞培養(yǎng)的主要內(nèi)容,1、單細胞培養(yǎng)（Single cell culture）2、懸浮培養(yǎng)（Suspension culture ）3、細胞培養(yǎng)實驗室器材 簡介,第一節(jié)：單細胞培養(yǎng) （Single cell culture）,單細胞的分離單細胞的培養(yǎng)方法影響單細胞培養(yǎng)的因子,?單細胞的分離,從外植體中直接分離單細胞從愈傷組織中分離單細胞通過原生質(zhì)體再生

4、法獲取單細胞,* 葉片是分離單細胞的最好材料 *,機械法：第一種方法：用刀片刮葉片 第二種方法：葉片研碎、離心 酶解法：,機械法第一種方法： 用刀片刮葉片,,機械法第二種方法：葉片研碎、離心,酶解法,Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞,,,,,從愈傷組織中分離單細胞 將愈傷組織進行振蕩培養(yǎng)，使其分散成小的細胞團伙單細胞，然后用適當孔徑的

5、細胞篩過濾，除去大的細胞團和殘渣，離心除去小的殘渣，得到單細胞懸浮液。,通過原生質(zhì)體再生法獲取單細胞 外植體、愈傷組織或細胞團通過纖維素酶和果膠酶等的作用，除去細胞壁得到原生質(zhì)體。,,?單細胞培養(yǎng)培養(yǎng)方法,液體淺層培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)法看護培養(yǎng)法微室培養(yǎng)法,1、液體淺層培養(yǎng)法,將懸浮在培養(yǎng)液中的細胞過濾，得到游離單細胞和小細胞團,,用途：主要用來增殖細胞。,,特點：,有利于有毒物質(zhì)的擴散；有利于氣體交換；不利于定點觀察；

6、單細胞生長、分裂后，難以得到單細胞系。,2、固體平板培養(yǎng)法,2-1 含義及用途：含義： 是將單個細胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。該方法是Bergmann(1960年)首創(chuàng)。 用途：是為了分離單細胞無性系，研究其生理、生化遺傳上的差異而設(shè)計的一種單細胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應用于細胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。,,2-2 特點,操作簡便；分離單細胞系比液體淺層培養(yǎng)容易；培養(yǎng)細胞氣體交換不暢。,,固

7、體培養(yǎng)基,2-3 平板培養(yǎng)的基本技術(shù) (1)、培養(yǎng)基配制 1.4%瓊脂基本培養(yǎng)基+等量細胞培養(yǎng)液=0.7 % 瓊脂條件培養(yǎng)基。（2）懸浮細胞密度的調(diào)制 平板培養(yǎng)要求最初細胞密度（即初始植板密度）為1×10 ³~ 100×10 ³ 個/ml 。初始植板密度：單細胞固體平板培養(yǎng)時，細胞懸浮液接種到瓊脂培養(yǎng)基上最初細胞密度。,調(diào)制方法：若懸浮液中細胞密度高，則加培養(yǎng)液稀釋；若懸浮液中細胞密度

8、過低，則通過離心使細胞沉淀后，取一定量的上清液使其達到所要求的密度。,,若懸浮液與培養(yǎng)基以1:4混合，則應把懸浮液的細胞密度調(diào)到 5×10 ³~ 500×10 ³ 個/ml。,（3）制平板：細胞懸浮液與融化狀態(tài)（35 ℃ ）條件培養(yǎng)基按一定比例均勻混合，倒成平板，蓋上培養(yǎng)皿蓋。用封口膜封嚴培養(yǎng)皿。 (4) 培養(yǎng)： 26℃置暗處培養(yǎng)21天。低倍顯微鏡觀察， 記數(shù)單細胞或小細胞團，計算置板效率（

9、也稱植板率）。,,,,,,,植板效率（或植板率）：已形成細胞團的百分數(shù)（即每100個鋪在平板上的細胞中有多少個能長出細胞團）。 植板效率= ×100%,,,該平板上接種的細胞數(shù),,每個平板上形成的細胞團數(shù),2-4 平板培養(yǎng)必須注意的方面,（1）選用的培養(yǎng)基，無論是否條件培養(yǎng)基，必須是能夠在低的初始植板密度下使細胞生長。（2）不要選用處在靜止期過久的

10、細胞。因為處在分裂旺盛時期的細胞才有最高的植板率。（3）在固體培養(yǎng)基中適宜的初始植板密度因植物種類而不同。如：煙草細胞適宜的為5~10 ×10 ³ 個/ml,若低于此數(shù)則植板率顯著下降。（4）接種時培養(yǎng)基的溫度要控制，一般不超過35 ℃ 。,3、看護培養(yǎng)法,3-1 看護培養(yǎng)的含義及用途含義：指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。用途；誘導形成單細胞系。Muir(1954)首先用

11、此法培養(yǎng)出煙草單細胞株。Sharp(1972)成功將此法用于番茄的花粉培養(yǎng)，誘導花粉形成單倍體細胞系。,看護培養(yǎng)（Nurse culture）圖示：,,,,,,,單細胞無性系,恒溫培養(yǎng)1個月,2~3月,用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖。這個愈傷組織稱塊為看護愈傷組織,3-2 看護培養(yǎng)基本技術(shù),（1）在一個培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。（2）在無菌的條件下，先將一小塊（1cm）活躍生長的愈傷

12、組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片（1cm²）已滅菌的濾紙，然后放置一個晚上。（3）將分離出的單個細胞接種到培養(yǎng)基的濾紙上。（4）恒溫培養(yǎng)。,3-4 特點： 1）效果好，易于成功。 2）簡便易行。 3）不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程。 注意：要得到單細胞系必須保證接種材料是真正的單細胞。,4-1 微室培養(yǎng)的含義及用途,含義：即將細胞培養(yǎng)在很少量的培養(yǎng)基中。用途：主要用來觀察細胞生長、分裂、形

13、成細胞團的過程。,4、微室培養(yǎng)法,,,微室培養(yǎng)（Microculture）圖示：,,,,,1滴含單細胞培養(yǎng)液,周圍加石蠟油,,,,,凹穴載玻片,,旁邊加石蠟油,,,,,,蓋蓋玻片,,,,,,,,蓋蓋玻片,,,,,,,,,,,,,,,,,,置培養(yǎng)皿中26~28 ℃恒溫培養(yǎng),4-2 微室培養(yǎng)特點：培養(yǎng)基用量少可通過顯微鏡觀察單個細胞的生長分裂、發(fā)育狀況有利于對細胞特性和單個細胞的生長發(fā)育的全過程進行跟蹤研究4-3 微室培養(yǎng)要

14、求： （1）微室內(nèi)不能有氣泡。（2）最好微室的厚度不要超過20微米，蓋 玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。（3）觀察時要保持溫度和培養(yǎng)時的一致。,植板密度較高時，與懸浮培養(yǎng)中或愈傷組織中相似的培養(yǎng)基即可；較低時，則成份非常復雜，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化學不明確物質(zhì)；,1、培養(yǎng)基成份2、初始細胞植板密度(>臨界密度),三、影響單細胞培養(yǎng)的因子,臨界密度：單細胞培養(yǎng)時，初始植板密度

15、低于某值培養(yǎng)細胞就不能進行分裂和發(fā)育成細胞團，則該值就是臨界密度。初始植板密度應根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況而改變，培養(yǎng)基越復雜則植板細胞的臨界密度越低，反之則相反。一般要求每毫升在1000個細胞以上。其他：植物生長激素、溫度、PH、二氧化碳含量等,第二節(jié)：細胞懸浮培養(yǎng) Suspension culture,特點：細胞可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分

16、化創(chuàng)造方法和條件。必須指出：懸浮培養(yǎng)中既有單細胞，也有細胞團。,概念：是指離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行無菌培養(yǎng)。由愈傷組織液體培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展而來。,1、起始懸浮液的制備,2、懸浮培養(yǎng)的基本形式,分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng),2-1、分批培養(yǎng)（Batch culture）,2.1.1 含義：將愈傷組織培養(yǎng)在一定容積的密閉容器中進行培養(yǎng)。它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。但要進行下一批培養(yǎng)，則生長一定時間后，需要繼代

17、轉(zhuǎn)移。,2.1.2 特點,培養(yǎng)基體積固定 培養(yǎng)過程中，細胞生長，其數(shù)目 不斷發(fā)生變化，呈S增長。 必須適當攪拌,2-2 連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture),2.2.1 含義：是相對分批培養(yǎng)而言的。連續(xù)培養(yǎng)是采用有效的措施讓微生物在某特定的環(huán)境中保持旺盛生長狀態(tài)的培養(yǎng)方法. 2.2.2 特點:：①高效，它簡化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等許多單元操作，從而減少了非生產(chǎn)時間和提高了設(shè)備的利用率；②自控，便于利用各種

18、儀表進行自動控制；③產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；④節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負荷均勻合理。,第三節(jié) 細胞培養(yǎng)實驗室器材 簡介,1.滅菌設(shè)備：高壓蒸氣滅菌鍋用于培養(yǎng)基、蒸餾水和接種器械的滅菌消毒。工作原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，0．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。,2.接種設(shè)備：無菌超凈工作臺用于培養(yǎng)材料的消毒及接種。使用前，將超凈工作臺上面的排風和殺菌按鈕開啟，滅