大鼠FasL基因重組慢病毒載體介導大鼠腎臟轉染的實驗研究.pdf

1、目的：三質粒系統(tǒng)包裝合成大鼠FasL基因重組慢病毒載體并用慢病毒載體體內、外轉染大鼠腎細胞，研究轉染后：FasL的表達。為進一步進行同種異體腎移植動物實驗、研究FasL基因轉染在同種異體移植中誘導免疫耐受的作用奠定基礎。 方法： 1.三質粒系統(tǒng)共轉染293-T包裝細胞，收集上清并用P24gag ELISA試劑盒對其定量。 2.原代培養(yǎng)大鼠腎細胞，F(xiàn)CM測定其Fas、FasL的表達。 3.分別用空白慢病毒

2、載體及FasL，慢病毒載體體外轉染原代培養(yǎng)大鼠腎細胞，RT-PCR、Western-blot鑒定轉染結果。 4.分別用空白慢病毒載體及FasL慢病毒載體經腎動脈體內轉染，于3天、7天、15天、25天、40天取腎標本，切片后分別用HE、IHC染色，觀察有無腎細胞形態(tài)改變、炎細胞浸潤、轉染后目的基因表達結果。 結果： 1.三質粒系統(tǒng)共轉染293-T包裝細胞合成慢病毒載體，P24gag ELISA法對其定量，空白慢病毒

3、載體及FasL慢病毒載體體濃度分別為13.8ng/ml、11.6ng/ml。 2.FCM測定大鼠原代培養(yǎng)腎細胞Fas、FasL的表達分別為3.36％、2.47％。 3.慢病毒載體體外轉染大鼠腎細胞，RT-PCR結果顯示目的基因載體在870bp有明顯條帶，而空白慢病毒載體未見明確條帶，Western-blot鑒定目的基因載體有明顯顯色條帶，而空白慢病毒載體未見顯色。 4.慢病毒載體體內轉染腎臟，目的基因

4、載體各時段樣本HE染色未見腎細胞形態(tài)改變及炎細胞浸潤，與空白組比較無明顯差異。IHC 染色目的基因載體轉染后15天出現(xiàn)表達高峰，經統(tǒng)計學處理15天、25天組與空白組比較有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，其它時段染色較空白組深，但經統(tǒng)計學處理與空白組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論： 1．成功合成FasL慢病毒載體并用P24gag ELISA對其定量。 2．大鼠腎細胞低表達Fas、FasL，適用于轉FasL研究