腺病毒介導(dǎo)的鈣粘蛋白11基因轉(zhuǎn)染大鼠牙髓細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1.分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠牙髓細(xì)胞，并建立高效穩(wěn)定的大鼠牙髓細(xì)胞培養(yǎng)方法。
　　2.構(gòu)建cadherin11腺病毒載體(Ad-Cadherin11)，并以此轉(zhuǎn)染大鼠牙髓細(xì)胞(rat dental pulp cells)，檢測cadherin11的表達(dá)，探討腺病毒介導(dǎo)的鈣粘蛋白11(Ad-Cadherin11)轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的大鼠牙髓細(xì)胞生長的影響，為進(jìn)一步研究cadherin11基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法

2、:
　　1.大鼠牙髓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:脫頸處死2月齡wistar大鼠，在無菌條件下劈開牙冠取大鼠的牙髓組織，并且切除根尖處約1mm左右的牙髓組織，將剩余牙髓組織剪成約1mm3左右，放入培養(yǎng)瓶并以1cm的間距均勻鋪于瓶底，加入含200ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞融合約為80～90％時(shí)，用0.25％的胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、貼壁及生長情況。取第3代大鼠牙髓細(xì)胞，收集細(xì)胞

3、樣品，石蠟包埋，并進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色，光鏡下觀察。
　　2.Ad-cadherin11轉(zhuǎn)染大鼠牙髓細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究:cadherin11載體構(gòu)建、293細(xì)胞擴(kuò)增復(fù)制重組腺病毒，測定病毒滴度。體外分離培養(yǎng)大鼠牙髓細(xì)胞，轉(zhuǎn)染病毒，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，并以細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。對轉(zhuǎn)染cadherin11目的基因后的大鼠牙髓細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析轉(zhuǎn)染后大鼠牙髓細(xì)胞的體外增殖情況，繪制生長曲線，并用

4、免疫細(xì)胞化學(xué)及半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)檢測目的基因cadherin11的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠牙髓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:(1)原代大鼠牙髓細(xì)胞呈圓形折光性強(qiáng)的細(xì)胞，貼壁后多數(shù)呈長梭形、成纖維狀，細(xì)胞逐漸增殖，呈集落狀生長，細(xì)胞排列緊密，周邊呈短梭形，體積較小，10d左右可單層融合。(2)傳代獲得的大鼠牙髓細(xì)胞大小勻稱，均勻鋪于培養(yǎng)瓶，為成纖維細(xì)胞狀，呈極性生長，在體外具有很強(qiáng)的增殖能力，5d左右即可單

5、層融合。(3)從生長曲線得出，開始兩天細(xì)胞生長較平緩，增殖慢，三天后細(xì)胞迅速增殖，一周后則呈平穩(wěn)狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)變化較小甚至逐漸減少，P10代后細(xì)胞逐漸老化，群體的倍增時(shí)間大約為6.71 h。(4)波形絲蛋白染色呈陽性反應(yīng)，而角蛋白染色則呈陰性反應(yīng)，這些均說明所培養(yǎng)得細(xì)胞是來源于中胚層的牙髓細(xì)胞。
　　2.Cadherin11轉(zhuǎn)染大鼠牙髓細(xì)胞的實(shí)驗(yàn):(1)成功構(gòu)建了Cadherin11腺病毒表達(dá)載體，測得病毒滴度均為:1×1010TU

6、/ml。(2) Cadherin11基因成功轉(zhuǎn)染大鼠牙髓細(xì)胞，在感染復(fù)數(shù)(MOI)為50時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠牙髓細(xì)胞效率達(dá)到最高，病毒轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞48h后，可看到超過70％的大鼠牙髓細(xì)胞出現(xiàn)熒光表達(dá)。(3)從生長曲線得出，實(shí)驗(yàn)組(Ad-cadherin11)與對照組(Ad-EGFP)及空白對照組相比，發(fā)現(xiàn)cadherin11目的基因?qū)ρ浪杓?xì)胞生長有明顯促進(jìn)作用。(4)免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR均檢測出攜目的基因?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞均顯示陽性反應(yīng)及高表達(dá)。<