腺病毒介導外源基因經(jīng)動脈灌注轉染大鼠帶蒂腹壁淺動脈皮瓣的研究.pdf

1、軸型復合組織瓣是整形外科醫(yī)生的常用工具，在難愈性創(chuàng)面及體表腫瘤切除后的修復重建過程中發(fā)揮重要作用。通過對復合組織瓣進行基因修飾等手段從而達到基因治療的目的，是目前整形外科的研究熱點之一。有穩(wěn)定血管供應的軸型復合組織瓣是良好靶組織，其微血管床是基因經(jīng)動脈灌注轉染的理想模型。動脈內灌注目的基因高效轉染修飾局部組織，使其表達治療蛋白，在移植醫(yī)學及介入醫(yī)學領域已有報道，但在整形外科領域研究剛剛起步，相關文獻報道較少。本課題在研究改良大鼠帶蒂腹壁

2、淺動脈皮瓣(Superficial inferior epigastric artery flap，SIEAflap)模型的基礎上，深入探討腺病毒載體介導外源基因(Ad5—EGFP)經(jīng)動脈介入灌注轉染復合組織瓣的可行性、安全性并對其轉染條件作出評價。本課題由以下四個部分組成： 1、大鼠帶蒂SIEA皮瓣經(jīng)動脈灌注模型的制備。 采用乳膠血管鑄型和墨汁灌注方法對大鼠SIEA皮瓣血供系統(tǒng)進行研究。并在此基礎上設計手術操作步驟，形

3、成大鼠帶蒂SIEA皮瓣的暫時與體循環(huán)分離的封閉回路，經(jīng)SIEA灌注PBS觀察對實驗大鼠及皮瓣存活的影響。結果顯示，應用微血管夾分步夾閉股動脈、肌支及腘動脈，在隱動、靜脈插管與注射泵相連，可形成由腹壁淺動、靜脈和帶蒂SIEA皮瓣微血管網(wǎng)共同構成的灌注封閉回路。設計微血管夾的夾閉步驟，使皮瓣缺血時間控制在5～10min以內，即對隱動、靜脈的插管固定時間。經(jīng)此操作灌注PBS術后SIEA皮瓣愈合正常，光鏡下檢測中性粒細胞計數(shù)與對照組相比無顯著差

4、異(P>0.05)。 2、Ad5—EGFP擴增純化及對大鼠微血管內皮細胞轉染效率的影響。 應用293細胞體外擴增、純化得到滴度為9×109PFU/mlAd5—EGFP，應用于后續(xù)細胞及動物實驗。以MOI=25、50、100、200、400、800轉染MVECs，轉染后1、3、7、14、21d應用熒光顯微鏡、流式細胞儀觀察檢測表達EGFP細胞陽性率。MTT法檢測轉染對MVECs增殖的影響，觀察安全MOI值范圍，并在此MOI

5、值條件下調整Ad5—EGFP轉染MVECs的時間(30min、60min、90min、120min)，應用流式細胞儀檢測轉染效率。結果顯示，Ad5—EGFP轉染MVECs后7d可見EGFP高表達，可延續(xù)到14d。在MOI≦400，Ad5—EGFP對MVECs轉染效率與MOI值呈正相關，且對轉染MVECs增殖無明顯影響，在此條件下Ad5—EGFP轉染MVECs60min即可達到78.5±1.9％轉染效率。 3、腺病毒介導EGFP經(jīng)

6、動脈灌注轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的研究。 實驗大鼠依據(jù)不同灌注液：Ad5—EGFP(3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109PFU/ml)、PBS、腺病毒空載體(Ad5—Null)，隨機分為6組。通過微血管夾暫時夾閉股動脈、肌支及胭動脈，在隱動、靜脈插管與注射泵相連，形成大鼠帶蒂SIEA皮瓣局部封閉回路，經(jīng)動脈灌注轉染大鼠帶蒂SIEA60min。術后7天應用活體成像系統(tǒng)觀察皮瓣的EGFP熒光強度，應用共聚焦

7、顯微鏡、RT-PCR檢測皮瓣組織中EGFP的表達和分布情況，通過組織學分析對皮瓣的安全性影響。結果顯示術后7天3.0×107—9PFU/ml組活體觀察皮瓣可見體表綠色熒光信號。共聚焦顯微鏡觀察結果與活體觀察結果一致，其中3.0×109PFU/mlEGFP在皮瓣內血管內、外膜均可見表達，血管周圍組織包括脂肪、毛囊可見EGFP表達。PBS組、Ad5—Null組未見EGFP表達。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測顯示EGFPmRNA與A

8、d5—EGFP滴度值3.0×107—9PFU/ml呈劑量依賴關系。對皮瓣組織學觀察未見明顯特異性炎癥反應。 4、不同轉染方式對大鼠SIEA皮瓣外源基因轉染及表達差異的研究。 分別經(jīng)尾靜脈注射，經(jīng)動脈灌注和皮瓣局部注射0.5ml3.0×109PFU/mlAd5—EGFP，術后1、3、7、14、21d活體成像系統(tǒng)檢測SIEA皮瓣EGFP表達的分布。另取三組同樣方法處理的大鼠，于術后7d取材用于從組織形態(tài)學及分子生物學兩方面評

9、價不同轉染方法對皮瓣局部EGFP表達的影響及不同轉染方法對全身重要臟器的影響。結果顯示，Ad5—EGFP在3.0×109PFU/ml滴度條件下，經(jīng)動脈灌注可以有效轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣，且對于大鼠重要臟器無明顯影響。經(jīng)尾靜脈注射不能夠有效轉染皮瓣，且在大鼠肝臟中可見EGFP表達。皮瓣局部注射可以有效轉染大鼠SIEA皮瓣，但與經(jīng)動脈灌注轉染相比，目的蛋白表達分布欠均勻?；铙w成像系統(tǒng)可以直觀檢測大鼠帶蒂SIEA皮瓣EGFP表達的強度及陽性

10、表達區(qū)域的分布。 綜上所述，本實驗建立了操作簡便、穩(wěn)定的大鼠帶蒂SIEA皮瓣經(jīng)動脈灌注研究模型。腺病毒載體可以將外源基因EGFP經(jīng)動脈灌注轉染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的微血管床，使大鼠帶蒂SIEA皮瓣作為目的基因表達載體并最終產生目的蛋白。與局部注射和全身轉染的方法相比，經(jīng)動脈灌注基因修飾復合組織瓣的方法局部靶向性更強并且對全身無明顯毒副作用。實驗中采用活體成像技術直接觀察術后皮瓣EGFP表達情況，使目的蛋白的檢測更加直觀，為進一步