經(jīng)動(dòng)脈灌注LV-mIL12轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣對(duì)在體乳腺癌SHZ-88細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究.pdf

1、基因治療作為一種前沿的治療手段在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，而靶向基因治療由于其良好的、有效的定向治療作用，極低的全身反應(yīng)，成為目前基因治療研究的熱點(diǎn)。皮瓣是整形外科的常用工具，在難愈性創(chuàng)面及體表腫瘤切除后的修復(fù)重建過程中發(fā)揮重要作用。通過對(duì)皮瓣進(jìn)行基因修飾，使其在腫瘤創(chuàng)面修復(fù)中兼具抗腫瘤作用，是整形外科領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展。目前應(yīng)用皮瓣的靶向基因治療在整形外科領(lǐng)域的研究剛剛起步，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本課題在大鼠帶蒂腹壁淺動(dòng)脈皮瓣(Superfi

2、cialinferiorepigastricarteryflap，SIEAflap)模型的基礎(chǔ)上，深入探討慢病毒載體(Lentivirus，LV)介導(dǎo)外源基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)經(jīng)動(dòng)脈介入灌注轉(zhuǎn)染復(fù)合組織瓣的可行性、安全性并對(duì)其轉(zhuǎn)染條件作出評(píng)價(jià)，并首次將抗腫瘤因子白介素12與慢病毒載體結(jié)合，經(jīng)動(dòng)脈灌注于皮瓣中，轉(zhuǎn)移于局部腫瘤創(chuàng)面，觀察其抗腫瘤效果。本課題由以下四個(gè)

3、部分組成：
　　 1、大鼠帶蒂SIEA皮瓣經(jīng)動(dòng)脈灌注模型的制備
　　 根據(jù)我們的前期研究結(jié)果，通過灌注美蘭對(duì)大鼠SIEA皮瓣血供系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)、研究，設(shè)計(jì)完善的手術(shù)步驟。設(shè)計(jì)大鼠帶蒂SIEA島狀皮瓣，通過暫時(shí)夾閉其它分支血供，形成一封閉回路，并經(jīng)SIEA灌注PBS觀察對(duì)皮瓣存活的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)皮瓣缺血時(shí)間在120min時(shí)，經(jīng)此操作灌注PBS術(shù)后SIEA皮瓣愈合正常，光鏡下檢測(cè)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(

4、P＞0.05)。
　　 2、慢病毒載體介導(dǎo)示蹤基因EGFP(LV-EGFP)經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的研究
　　 體外轉(zhuǎn)染皮瓣中的主要成分細(xì)胞：大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Rataorticendothelialcell，RAEC)、大鼠的皮膚成纖維細(xì)胞(Ratdermalfibroblast，RDF)、人的皮膚成纖維細(xì)胞(Humandermalfibroblast，HDF)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Hurmanumbili

5、calveinendothelialcell，HUVEC)，觀察不同時(shí)間、不同感染復(fù)數(shù)(Multiplicityofinfection，MOI)下的轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)水平，尋找最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)及轉(zhuǎn)染時(shí)間。結(jié)果顯示，對(duì)于HDF、HUVEC，LV-EGFP在MOI=50即可有50％以上感染率，在MOI=200時(shí)感染率可達(dá)到80%以上。對(duì)于RDF和RAEC，在MOI=200時(shí)可有70%感染率。因此，在MOI=200時(shí)對(duì)所有的細(xì)胞均具有較高的感染率

6、，且不影響細(xì)胞活力。對(duì)于HDF和HUVEC，在MOI=200時(shí)感染2h即可達(dá)到滿意效果。對(duì)于RDF和RAEC感染時(shí)間越長(zhǎng)越好（12h之內(nèi)），感染2h基本可以保證感染率在50%以上。
　　 慢病毒介導(dǎo)EGFP經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣的研究：實(shí)驗(yàn)大鼠依據(jù)不同灌注液：LV-EGFP(1.0×108TU/ml、5.0×108TU/ml、1.0×109TU/ml)、PBS，隨機(jī)分為4組。按第一部分所訴，經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SI

7、EA皮瓣120min。術(shù)后第7、14、21、28、40天對(duì)外源基因在各組SD大鼠帶蒂SIEA皮瓣的表達(dá)和分布情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：PBS（A組）和LV-EGFP1.0×108TU/ml（B組）、LV-EGFP5.0×108TU/ml（C組）不能有效轉(zhuǎn)染皮瓣。1.0×109TU/ml（D組）可以有效轉(zhuǎn)染皮瓣，在術(shù)后40天仍有表達(dá)，對(duì)肝、腎無(wú)影響。
　　 3、目的基因mIL12(murineInterleukin-12，mIL12

8、)過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及功能檢測(cè)
　　 選取具有抗腫瘤作用的IL12作為目的基因，以pORF-mIL-12為模板，PCR調(diào)取目的基因，與表達(dá)載體重組，采用三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建重組白介素12慢病毒(LV-mIL-12)。以構(gòu)建好的LV-mIL-12感染人及大鼠皮膚成纖維細(xì)胞(HDF、RDF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC、RAEC)，檢測(cè)mIL-12過表達(dá)及生物活性。結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了白介素12重組慢病毒包裝質(zhì)粒，能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

9、。LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要幾種細(xì)胞，并分泌有生物活性的mIL-12。
　　 4、LV-mIL12經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂的SIEA皮瓣對(duì)大鼠SH2-88乳腺癌細(xì)胞的影響
　　 行大鼠SH2-88乳腺癌細(xì)胞皮瓣皮下接種法建立大鼠乳腺癌模型，將SD大鼠經(jīng)動(dòng)脈灌注液不同：LV-mIL12、LV-EGFP、PBS隨機(jī)分為三組。按前文所述制備SIEA島狀皮瓣，經(jīng)動(dòng)脈灌注不同灌注液，分別于術(shù)后的第1～40天，觀察負(fù)瘤鼠

10、生長(zhǎng)情況、SIEA皮瓣成活情況及局部瘤體生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：在術(shù)后的28天，ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組皮瓣中央及皮瓣周圍均有mIL12表達(dá)，皮瓣中央處表達(dá)量＞皮瓣周圍＞對(duì)照組。經(jīng)動(dòng)脈灌注LV-mIL12轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂SIEA皮瓣在早期（7～15天）抑制了局部腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。但到第20天后腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基本持平，腫瘤體積不再明顯長(zhǎng)大。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的大鼠帶蒂SIEA皮瓣經(jīng)動(dòng)脈灌注研究模型。證實(shí)慢病毒載