腺病毒介導野生型p53基因轉(zhuǎn)染左向右流型肺動脈高壓大鼠的試驗研究.pdf

1、目的:研究重組腺病毒介導的野生型p53基因轉(zhuǎn)染左向右分流型先心病肺動脈高壓大鼠，觀察轉(zhuǎn)染后目的基因的表達情況，及其對肺動脈高壓的抑制作用和對肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的影響。 方法:將pCMVp53重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)BamH1和NheI酶切，得到p53基因cDNA，然后將cDNA片段克隆到轉(zhuǎn)移載體pCMV5GFP，使其受CMV5啟動子的調(diào)控，獲得pCMV5p53重組轉(zhuǎn)移載體，用該線狀重組轉(zhuǎn)移載體與腺病毒右臂DNA經(jīng)磷酸鈣共轉(zhuǎn)染293

2、細胞獲得重組腺病毒，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定p53蛋白含量，證明外源p53基因在含重組腺病毒的293細胞中得到表達。同法創(chuàng)建對照組病毒Adeno-lacZ。48只大鼠隨機分為4組：Ⅰ組(n=10)為空白對照組，僅做假手術(shù)處理；Ⅱ組(n=13)為模型對照組，通過套管法建立左向右分流型PH模型：Ⅲ組(n=14)為實驗組，建立PH模型，并通過氣管吸入法轉(zhuǎn)染Adeno-p53重組腺病毒；Ⅳ組(n=1.1)為實驗對照組，建立PH模型，并

3、通過氣管吸入法轉(zhuǎn)染Adeno-lacZ重組腺病毒。16周后右心導管法測量各組大鼠右室平均壓(mRVP)和肺動脈平均壓(mPAP)，計算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)及RV/BW，評估野生型p53基因?qū)δＰ痛笫笱鲃恿W的影響，HE染色觀察小動脈結(jié)構(gòu)、測量小動脈管徑及管壁厚度計算WT％，Ⅲ、Ⅳ組Western blot法鑒定p53基因產(chǎn)物在肺組織中的表達。采用免疫組織化學方法研究肺動脈平滑肌細胞PCNA的表達，并通過原位缺口末端標記方法(TU

4、NEL)檢測大鼠肺動脈平滑肌細胞的凋亡，分別計算增殖指數(shù)(PI)、凋亡指數(shù)(AI)及PI/AI。 結(jié)果:Ⅰ.Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的mRVP、mPAP及WT％均明顯高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅳ組RVHI明顯高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組的mPAP、mPVP、RVHI及WT％明顯降低(P<0.05)，但與Ⅰ組相比，Ⅲ組的mPAP、mPVP及WT％仍明顯高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅳ組相比，Ⅲ組的各項指標均低于Ⅳ組(P<0.0

5、5)。HE染色標本上可見，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺動脈肌層及內(nèi)膜均有不同程度的增厚以及肺小動脈肌化管腔狹窄；而Ⅱ組血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞連續(xù)，管壁薄，厚度均勻一致。 2.Western blot結(jié)果示Ⅲ組出現(xiàn)特異性條帶，提示目的基因已成功表達功能蛋白。 3.轉(zhuǎn)染野生型p53基因的Ⅲ組，PI明顯低于Ⅱ組與Ⅳ組(P<0.05)，AI明顯增高，高于其他三組(P<0.05)，PI/AI明顯低于Ⅱ組與Ⅳ組(P<0.05)。 結(jié)論: