重組腺病毒介導人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因對惡性腫瘤生物治療的臨床前研究.pdf

1、惡性腫瘤因其高發(fā)病率、高死亡率近年來一直是嚴重危害人類健康的重要疾病之一。目前臨床上常用的治療方法(手術、化療和放療)都存在一定的局限性，因此需要探索新的更加有效的治療方法。本室構建的攜帶人野生型p53基因和腫瘤免疫相關基因GM-CSF、B7-1的重組腺病毒(命名為重組腺病毒BB-102抗癌劑)，感染喉癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和慢性髓性白血病原代細胞后，能明顯抑制癌細胞的增殖并誘導其凋亡，而且體外能誘導自體外周血淋巴細胞生成腫瘤殺傷性的C

2、TL。本實驗對該重組腺病毒進行了臨床前研究，完成了以下工作： 1.重組腺病毒的制備、質量標準和質量控制協(xié)助中國藥品生物制品質量檢定所擬訂了《重組腺病毒BB-102制造和檢定規(guī)程》。在293細胞中分別擴增BB-102以及攜帶綠色熒光蛋白基因的對照重組腺病毒Ad-GFP；以氯化銫密度梯度超速離心法純化病毒；以蝕斑分析法測定病毒滴度；按照《中國生物制品規(guī)程》之通則和《重組腺病毒BB-102制造和檢定規(guī)程》，檢測重組腺病毒BB-102的

3、質量。結果表明：Ad-GFP和BB-102的滴度分別為1.1×1011和5×1010；重組腺病毒BB-102的質量符合以上兩個規(guī)程的要求。 2.重組腺病毒BB-102抗癌劑穩(wěn)定性研究探討不同溫度和不同保護劑對重組腺病毒載體穩(wěn)定性的影響。以含10％甘油的Hank's液保存BB-102和Ad-GFP，以快速細胞病變法、ELISA法、流式細胞儀、電鏡觀察分別檢測在不同溫度不同保存期重組腺病毒載體的滴度、轉染率、目的基因表達的變化。結果

4、顯示-60℃保存55個月、-20℃保存44個月時各項指標無明顯變化；4℃保存不宜超過3個月；不宜室溫保存。結論：本制劑保存于-20℃以下性能穩(wěn)定，可滿足臨床儲存和應用。 以不同濃度的甘油、明膠、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇為保護劑，室溫保存Ad-GFP，保存期分別為1～4天、1～4周、1～3月。檢測其滴度、轉染率和目的基因表達。結果顯示：濃度小于1％的明膠具有較好的保護作用，3個月時病毒仍有較高的轉染率。乳糖、蔗糖

5、和甘露醇也可作為室溫保存時的備選保護劑，但保存期限不宜超過1個月。 3.重組腺病毒BB-102抗癌劑生物體內有效性研究探討重組腺病毒介導的p53、B7-1和GM-CSF基因(BB-102)對荷瘤裸鼠體內人喉癌細胞的基因治療效果，為喉癌基因治療臨床研究提供依據。建立喉癌裸鼠模型，瘤內注射BB-102、Ad-GFP和PBS，對腫瘤組織進行測量、病理學檢查、免疫組化等研究。在實驗組與對照組之間經多因素析因方差分析，腫瘤重量和瘤體積具有

6、顯著性差異。經治療后，實驗組腫瘤中未發(fā)現(xiàn)突變型p53的表達，Ki67陽性表達率極低，光鏡和透射電鏡下可見腫瘤細胞的凋亡。BB-102在喉癌細胞中有效表達，抑制其生長，誘導其凋亡；5×108pfu是體內實驗的最佳起始有效劑量。 4.重組腺病毒BB-102抗癌劑的安全性評價BB-102急性毒性試驗表明：小鼠肌肉和腹腔注射BB-102，未見明顯的毒性反應。小鼠一次肌肉注射BB-102，雌性小鼠MTD大于4.84×1011pfu/kg，

7、雄性小鼠MTD大于4.67×1011pfu/kg；小鼠一次腹腔注射BB-102，雌性小鼠MTD大于4.87×1011pfu/kg，雄性小鼠MTD大于4.74×1011pfu/kg。 BB-102慢毒性試驗結果表明：獼猴連續(xù)15次皮下注射5.0x10810pfu/kg腺病毒BB-102抗癌劑后未見任何不良反應。連續(xù)皮下注射15次5.0x109和5.0x1010pfu/kg的BB-102后，除了與效應有關的白細胞計數(WBC)、血小

8、板計數(PLT)、網織紅細胞數藥后有劑量依賴性升高外，其余各項觀測指標未見明顯變化。故可認為5.0x108pfu/kg以下為安全劑量。 給藥8次后血清中出現(xiàn)抗Adv的中和抗體，停藥30周后中和抗體消失。 除注射部皮膚、肌肉、肝臟和肺臟有重組腺病毒載體分布外，其他組織器官未檢測到其分布。 一般藥理試驗結果表明：重組腺病毒BB-102抗癌劑對動物的一般行為狀態(tài)、中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、腸蠕動無明顯的影響。